Sviluppo di un nuovo anticorpo monoclonale diretto verso l’antigene mesotelina per applicazioni nella terapia e nella diagnosi oncologica

Le cellule di mieloma e gli splenociti sono stati mescolati in un rapporto di 1:7,4 rispettivamente quindi la sospensione cellulare è stata centrifugata a 250 x g per 10 minuti a 20°C. Dopo la centrifuga è stato eliminato accuratamente tutto il terreno ed il pellet cellulare è stato delicatamente staccato dal fondo ed il tubo è stato immerso in un bagnetto termostatato a 37°C e mantenuto in agitazione continua per il resto della fusione. Si è proceduto aggiungendo alle cellule 1 ml di PEG 1500 (50%) ad una velocità di 1 ml/min mantenendo in agitazione per 2-3 minuti. Quindi è stato aggiunto 1 ml di terreno incompleto pre-riscaldato a 37°C sempre ad una velocità di 1 ml/min continuando ad agitare il campione per un altro minuto. Si è proceduto con altri 3 ml di terreno incompleto ad una velocità di 1 ml/min agitando il campione, infine sono stati aggiunti altri 10 ml di terreno pre-riscaldato sempre lentamente e si è concluso incubando per 5 minuti nel bagnetto a 37°C. Le cellule sono state centrifugate e risospese in terreno di crescita completo RPMI-1640 (FBS al 20%). La sospensione cellulare è stata poi piastrata in piastre da 24 pozzetti dove erano stati preliminarmente piastrati i macrofagi irradiati.
Dopo 24 ore il terreno di coltura è stato sostituito con il terreno selettivo contenente ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT) che permette la sopravvivenza dei soli ibridomi cellula B-cellula mileomatosa. Solo l’ibridoma cellula B-cellula mielomatosa, che ha l’enzima HPRT fornitogli dalle cellule spleniche, può utilizzare l’ipoxantina e la timidina esogene e quindi sopravvivere e moltiplicarsi nel terreno di selezione.
Dopo due settimane, sono stati prelevati i sovranatanti dai pozzetti che avevano raggiunto la confluenza e testati mediante analisi citofluorimterica su cellule mesotelina positive e mesotelina negative, per individuare la presenza o meno di anticorpi specifici anti-mesotelina. Le cellule dei pozzetti, che dall’analisi al FACS sono risultati positivi per la produzione di anticorpi anti-mesotelina, sono state clonate tramite la tecnica della diluizione limite in piastre da 96 pozzetti su cui sono stati precedentemente piastrati i macrofagi. Dopo circa 14 giorni, sono stati testati i sovranatanti dei cloni cellulari al FACS per riconoscere quali cloni producevano anticorpi anti-mesotelina. I cloni risultati positivi, sono stati espansi e adattati nel terreno di coltura Hybridomed (Bichrom AG, Berlino, Germania) addizionato di penicillina/streptomicina 2 mM. L’adattamento è stato eseguito in modo graduale, per evitare la morte degli stessi. Gradualmente è stata ridotta la percentuale di terreno HAT a favore inizialmente del terreno contenente solo HT (Hipoxantine Thymidine) (Sigma Aldrich, S. Louise, USA). Si è passati dal 100% HAT, al 75%, al 50%, al 25% e infine 0% e contemporaneamente da 0% HT al 25%, al 50%, al 75% e infine al 100% di HT. Successivamente i cloni sono stati adattati sempre in modo graduale al terreno RPMI-1640 al 20% FCS. Infine, sono stati adattati in Hybridomed, che è un terreno specifico per la crescita degli ibridomi. Ad ogni cambio di terreno i cloni sono stati analizzati al citofluorimetro per controllare il mantenimento della specificità nel produrre anticorpi monoclonali diretti verso l’antigene mesotelina.