Eziopatogenesi molecolare delle Encefalomiopatie Mitocondriali

Un numero sempre crescente di disordini ad interessamento multisistemico riconosce come causa una possibile disfunzione a carico della catena respiratoria mitocondriale. Una volta sospettata una patologia di tipo mitocondriale sulla base di dati clinico-laboratoristici, la definitiva diagnosi viene raggiunta solo dopo aver evidenziato lo specifico difetto molecolare ed averne confermato la patogenicità attraverso una serie di criteri indipendenti: possibile natura eteroplasmica in specifici tessuti, segregazione con il fenotipo clinico, correlazione con difetti molecolari dimostrabili a livello tissutale ed in sistemi cellulari. Inoltre alcune mutazioni del genoma mitocondriale (mtDNA) sono associate a pattern clinici predicibili, ma spesso il grado di variabilità oltrepassa la stretta correlazione genotipo-fenotipo, suggerendo l'implicazione di altri fattori, inclusi quelli derivanti da particolari aplotipi del mtDNA o da differenti background nucleari. Lo studio, condotto nella prima parte del progetto, prevedeva l'impiego di tecniche robotizzate di sequenziamento massivo onde acquisire genomi mitocondriali interi per la "detection" di nuove mutazioni e di nuove possibili correlazioni della variabilità clinica delle encefalomiopatie mitocondriali. Nella seconda parte del progetto l'applicazione di metodiche post-genomiche, basate sulla valutazione dell’espressione genica tramite microarrays e Real-Time PCR, ha permesso di investigare sorgenti di variabilità clinica legate all’assetto genico nucleare.
Una revisione dei dati di 212 pazienti affetti da encefalomiopatia mitocondriale, raccolti presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche dell'Università di Milano, ha permesso finora di identificare 175 mutazioni del mtDNA, ma in almeno 37 di questi pazienti, con un quadro clinico suggerente ad una patologia mitocondriale, la diagnosi genetica è rimasta misconosciuta. I dati di sequenziamento massivo, ottenuti tramite una stazione robotizzata associata a sequenziatore multicapillare, sono stati confrontati con la sequenza del mtDNA di riferimento. Sono state identificate 165 sostituzioni nel genoma mitocondriale; di queste 124 sono polimorfismi conosciuti. Delle restanti 41 varianti, 33 sono presenti in uno stato omoplasmico all’analisi con RFLP sia nel muscolo sia nel sangue del soggetto investigato. Queste varianti hanno contribuito ad aumentare la casistica sui polimorfismi mitocondriali nei database esistenti. Le altre 8 mutazioni sono sicuramente patogeniche: 3 nuove mutazioni eteroplasmiche (a carico di ND3, ND5 e tRNA His) ed altre 5 precedentemente descritte in casi isolati.
Il polimorfismo omoplasmico A12308G, variante comune che definisce l'appartenenza all'aplotipo europeo "U", ha un ruolo molto discusso dalla comunità scientifica. La ricerca ha investigato il ruolo di questo polimorfismo mitocondriale nell’influenzare il fenotipo in pazienti affetti da sindrome di Kearns Sayre (KSS). Nello studio si osserva che la frequenza del polimorfismo A12308G è presente nel 18.9% nella popolazione di controllo, 17.5% nel gruppo di pazienti affetti da una qualsiasi delle mutazioni puntiformi mitocondriali e 18.2% nei pazienti con delezioni multiple. Tale frequenza è invece pari al 38,1% (p<0.005) nel gruppo di pazienti affetti da macrodelezione del mtDNA. Per investigare se la presenza di questo polimorfismo influenzasse la variabilità delle manifestazioni patologiche osservabili nei pazienti KSS, si sono stratificate i differenti fenotipi per la presenza (39 casi) o assenza (24) dell’A12308G. Si osserva che i pazienti con la transizione presentano un rischio significativamente maggiore di sviluppare retinite pigmentosa, disartria/disfagia, bassa statura e problemi cardiaci.
La PEO è un disordine neurodegenerativo associato con la presenza di delezioni del mtDNA e con mutazioni del gene POLG1, codificante la DNA polimerasi gamma mitocondriale. L’analisi molecolare del gene POLG1 in 8 pazienti PEO ha permesso di identificare alcune mutazioni recessive, 5 delle quali nuove. Il seguito della ricerca ha indagato la rilevanza patologica derivante dall'accumulo di mutazioni del mtDNA, analizzandone la regione di controllo della replicazione (D-Loop). Abbiamo evidenziato che i pazienti PEO, con almeno una mutazione nel gene POLG1, presentano carichi mutazionali significativamente aumentati. Specifiche mutazioni del gene POLG1 alterano l’integrità del genoma mitocondriale, dando luogo all’accumulo di elevati livelli eteroplasmici di mutazioni puntiformi nel mtDNA.
La teoria mitocondriale dell'invecchiamento ipotizza che l'accumulo di mutazioni somatiche nel mtDNA durante gli anni potrebbe rappresentare la causa principale dell'invecchiamento. Il D-Loop, potendo contenere più mutazioni eteroplasmiche, è la porzione del genoma a più elevata variabilità. Abbiamo evidenziato la presenza di alti livelli mutazionali nel D-Loop in tutte le fibre muscolari provenienti da soggetti sani ultranovantenni.