Caratterizzazione strutturale dell'inibitore delle chinasi ciclino dipendenti p27

Scopo di questo progetto di tesi, svolto in collaborazione con il Dott. G. Viglietto del Centro di Endocrinologia ed Oncologia Sperimentale del CNR di Napoli (CEOS), è quello di identificare i siti di fosforilazione dell’inibitore delle chinasi ciclino-dipendenti p27, quali segnali in grado di modularne l’attività. In particolare si è voluto verificare se p27 costituisca, in vitro, effettivamente un substrato per le protein chinasi AKT e PKA. Questo studio è di particolare interesse, in quanto le modifiche dell’oncosoppressore p27 sembrano avere un ruolo importantissimo in numerosi processi di cancerogenesi.
Ai fini della determinazione dei siti di fosforilazione sono state utilizzate le tecniche complementari di mutagenesi specifica, marcatura con 32P e tecniche avanzate di spettrometria di massa, descritte precedentemente. E’ stato messo a punto un protocollo di espressione e purificazione della proteina p27 wt e dei suoi mutanti, in forma ricombinante. L’espressione e la purificazione dei mutanti di p27 si è resa necessaria per condurre esperimenti in vitro sull’attività delle chinasi, utilizzando ATP-radiomarcato. Quest’ultimo tipo di esperimenti sono stati condotti presso i laboratori del CNR in collaborazione col Dott. Viglietto. Le proteine ottenute in forma pura sono state caratterizzate mediante tecniche di spettrometria di massa . Per condurre gli esperimenti di fosforilazione su p27 wt e mutante, sono state utilizzate le protein-chinasi, PKA ricombinante, AKT ricombinante e AKT ottenuta da immunoprecipitato. Le proteine fosforilate sono state caratterizzate mediante analisi ESI/MS. Per l’identificazione dei siti fosforilati sono state utilizzate tecniche di proteolisi estensiva accoppiate ad analisi di spettrometria di massa MALDI e a tecniche di LC/MS.