Specificità mutazionale dei ceppi di Bacillus subtilis alterati nei geni coinvolti nel sistema di riparazione degli appaiamenti scorretti o MMR

LP-MMR é un tipo di meccanismo riparativo post-replicativo metil-diretto bidirezionale, in grado di riconoscere e correggere gli appaiamenti errati che si originano durante la fase di replicazione del DNA. Questo sistema riparativo in E. coli é dovuto all'azione concertata di proteine quali MutS (in grado di riconoscere l'appaiamento scorretto), MutH (endonucleasi che incide specificamente il filamento da riparare, in genere quello di nuova sintesi), MutL (che agisce da interfaccia tra MutS e MutH attivando il complesso). Questo modello riparativo é in grado di operare l'escissione di basi di lunghi tratti dopo la replicazione.
Il MMR interviene anche in processi diversi da quello di riparazione post-replicativa quali la creazione della barriera interspecifica (non in tutti gli organismi), e partecipa al controllo del ciclo cellulare.
Nel caso di Bacillus subtilis i geni mutS e mutL sono i responsabili del MMR e sono organizzati in un operone dicistronico (localizzato a circa 150° sul cromosoma batterico a valle del gene cotE ), non é stata identificata un proteina analoga a MutH. Si ritiene che il segnale riconosciuto per l'identificazione del filamento di nuova sintesi sia la presenza e l'accumulo su questo di incisioni, quali intermedi della sintesi di DNA. L'inattivazione dell'intero operone MutSL comporta un aumento della frequenza di mutazione di 40 - 60 volte.


Sequenziamento del genoma di B. subtilis

Nel 1997 é stata completata l'intera sequenza del ceppo PB 168 di Bacillus subtilis. Il genoma di B. subtilis é costituito da una molecola circolare a doppia elica di DNA formato da 4.214.800 bp dalla cui sequenza nucleotidica sono stati individuati 4.100 geni.
yshD é una ORF (pen reading frame) identificata nell'ambito del progetto di sequenziamento del genoma di B. subtilis 168, localizzata all'interno di una regione di 114 Kb (tra i geni dnaB - pheA) il cui prodotto é stato inizialmente classificato come proteina coinvolta nel sistema di riparazione degli appaiamenti scorretti LP-MMR. yshD fa parte di un operone tricistronico di 4.6 Kb, caratterizzato dalla presenza di un terminatore putativo indipendente ad ogni estremità, insieme a yshE e yshC che codificano rispettivamente per una proteina a funzione ignota e per una proteina che presenta un certo livello di somiglianza con la DNA pol  eucariotica, coinvolta nel sistema riparativo per escissione di basi (BER). yshD, é lunga 2355 bp e codifica una proteina di 785 aminoacidi, che, in base al confronto con il corredo genetico di organismi quali Synechocistis, H. pylori e B. burgdorferii, é stata classificata come appartenente alla famiglia delle proteine MutS2 ed é stata definita paralogo di MutS. In E. coli non sono stati identificati paraloghi di MutS o YshD, si é perciò ipotizzato che quest'ultima funzione, al pari degli omologhi di MutS negli eucarioti, riconosca misappaiamenti diversi dal punto di vista molecolare oppure agisca in processi cellulari diversi. yshD é normalmente espresso a livello di trascrizione durante tutto il ciclo vitale del batterio.
Studi condotti sul possibile ruolo di yshD nell'ambito della creazione e mantenimento della barriera interspecifica, hanno messo in evidenza la sua totale estraneità. Da ulteriori studi si é osservato che YshD non ha un ruolo nel LP-MMR.


Scopo del lavoro

Lo scopo di questo lavoro é verificare se yshD é comunque funzione implicata nel riconoscimento di appaiamenti scorretti, pur non partecipando a LP-MMR, né ai processi successivi alla formazione di eteroduplici quali intermedi della ricombinazione. In particolare ci si é proposto di analizzare lo spettro di mutazione spontanea a RifR in ceppi selvatici e con la mutazione ∆yshD, rispetto a ceppi ∆mutL, WT e ∆mutSL ed in un doppio mutante ∆mutL/ ∆yshD. A tale scopo abbiamo usato, come gene bersaglio per la valutazione della natura e della frequenza delle mutazioni spontanee in avanti (spettro di mutazione), il gene rpoB di B. subtilis. Il gene rpoB codifica per la subunità  della RNA polimerasi ed é altamente conservato. Mutazioni nella subunità della RNA polimerasi sono responsabili della resistenza alla Rifampicina, un antibiotico che agisce a livello di questa subunità bloccandone l'azione. Questo lavoro di tesi consente anche di verificare in B. subtilis, sia nel ceppo selvatico che nei vari mutanti presi in esame, la natura delle sostituzioni aminoacidiche che consentono la resistenza all'antibiotico. Questo era stato valutato solo in E. coli, organismo nel quale la collocazione di tali mutazioni é confinata a regioni discrete del gene rpoB, codificanti per particolari domini detti cluster I e II.