Allestimento di una curva di crescita cellulare

Costruire una curva di crescita e' importante per stabilire le caratteristiche di crescita delle nostre cellule. E' una cosa piuttosto semplice da fare e ci dà informazioni sul tempo di duplicazione e quindi sulla frequenza delle divisioni (passaggi) della coltura, e ci permette di calcolarci sempre il numero di cellule necessarie o disponibili per i nostri esperimenti. Se usiamo cellule in sospensione, il giorno 0 dobbiamo prepararci 3 fiasche con una concentrazione di 1x105 cell/ml e contarle accuratamente tutti i giorni per almeno 5 giorni. Dobbiamo registrare per ciascun punto il numero di cellule contate e l'ora in cui e' stato contato il campione. Se usiamo cellule adese, queste vanno inoculate ad una densita' di 1x105 cellule in piastre petri da 90 mm di diametro, oppure in altri tipi di Petri o di fiasche, facendo attenzione di aggiustare la concentrazione cellulare alla superficie disponibile. Per questo tipo di curva di crescita dovremo preparare 3 fiasche per ogni giorno, quindi in tutto 15 fiasche (è ovvio che è inutile fare delle fiasche o delle Petri troppo grandi, perché ci costeranno di più ed è inutile avere tante cellule). Ogni giorno verranno tripsinizzati e contati 3 campioni, segnando anche qui il giorno e l'ora della conta. Le curve di crescita possono venire costruite usando della carta millimetrata normale, ma è più semplice usare una carta semilogaritmica, su cui riportare direttamente il numero di cellule per campione. Il grafico viene costruito mettendo il tempo in ascissa e il numero di cellule in ordinata. Il grafico dovrebbe mostrare una fase iniziale di crescita lenta (lag phase o fase di latenza), poi una fase in cui la concentrazione cellulare cresce in un modo logaritmico (fase esponenziale o log fase) e infine di nuovo una fase di crescita lenta seguita da una fase in cui la coltura rimane numericamente costante (fase di plateau o steady state o stato stazionario). Possiamo riportare i dati su scala semilogaritmica, oppure trasformare i dati calcolando il logaritmo in base 10 del numero di cellule (o della concentrazione cellulare): la fase esponenziale dovrebbe apparire come una retta, la fase di latenza e di plateau dovrebbero apparire come due segmenti a pendenza minore. Costruendo la curva di crescita possiamo valutare alcuni parametri generali della coltura: tuttavia e' interessante anche conoscere la frazione di cellule poliferanti ed eventualmente la durata della fase di sintesi del DNA e della mitosi: difatti il tempo di duplicazione della nostra coltura dipende da questi parametri, oltre che dalla uscita dal ciclo cellulare delle cellule per morte o per differenziamento. La sintesi del DNA viene di solito valutata utilizzando come tracciante un nucleotide, precisamente la timidina marcata con trizio (3H) se utilizziamo un saggio radioattivo o l'analogo della timina, la bromo-desossi-uridina (BrdU) da rivelare con un'opportuna sonda fluorescente se utilizziamo appunto un saggio fluorimetrico. I saggi condotti sia con 3H-timidina che con BrdU possono essere effettuati o lasciando incorporare per tempi anche molto lunghi il nostro tracciante nella coltura, e cosi' conosceremo la frazione proliferante della nostra coltura, o esponendo la coltura per un tempo breve (esperimenti di pulse-chase) e seguendo nel tempo la distribuzione del tracciante nelle coltura, e cosi' conosceremo la durata delle diverse fasi.