Esempi di regolazione genica in passaggi successivi all'inizio di trascrizione

Alcuni fagi hanno soltanto una strategia di sopravvivenza e, quando infettano un ospite suscettibile, ne sovvertono le funzioni allo scopo di produrre un grande numero di particelle fagiche figlie. Come risultato di questa infezione litica, il batterio ospite muore. Nel tipico ciclo litico, il DNA del fago (o l'RNA) entra nell'ospite batterico, i suoi geni sono trascritti in ordine stabilito, il materiale genetico del fago viene replicato e si producono i componenti proteici della particella fagica.  Alla fine l'ospite batterico viene distrutto (lisato) per rilasciare le particelle figlie. Altri fagi hanno, invece, una doppia vita e sono capaci di perpetuarsi usando lo stesso tipo di ciclo litico come strategia per produrre il numero più alto di copie del fago nel minor tempo possibile, ma hanno anche una forma alternativa di esistenza, in cui il genoma del fago è presente nel batterio in una forma latente nota come profago. Questa forma di propagazione si chiama lisogenia. In un batterio lisogeno, il profago è inserito (integrato) nel genoma batterico e viene ereditato nello stesso modo dei geni batterici. In virtù della presenza di un profago, un batterio lisogeno ha un'immunità contro l'infezione di ulteriori particelle fagiche dello stesso tipo. Fra il modo litico e quello lisogeno avvengono transizioni che dipendono dalle condizioni di infezione e dai genotipi del fago e del batterio. Infatti, un profago può essere liberato dalle restrizioni della lisogenia dal processo chiamato induzione. Per prima cosa il fago è rilasciato dal cromosoma batterico per escissione e quindi il DNA libero procede attraverso la via litica. Comunque, la lisogenia è mantenuta dall'interazione di un repressore fagico con un operatore, mentre il ciclo litico richiede una cascata di controlli trascrizionali. La transizione fra i due stili di vita è compiuta stabilendo una repressione (da ciclo litico a lisogenia) o rilasciando un repressore (induzione da fago lisogeno a fago litico). Un altro tipo di esistenza all'interno dei batteri è rappresentato dai plasmidi, che sono unità autonome che esistono nella cellula come genomi extracromosomici. I plasmidi sono molecole circolari di DNA che si autoreplicano e sono mantenute nella cellula in un numero stabile e caratteristico. Alcuni plasmidi hanno anch'essi stili di vita alternativi e possono esistere nello stato autonomo o possono inserirsi nel cromosoma batterico e diventare dunque episomi.
In generale, il fago comprende geni la cui funzione è quella di assicurare la replicazione del suo DNA all'interno dell'ospite. Lo sviluppo litico si svolge in una via in cui i geni del fago sono espressi in un ordine particolare, che assicura che la quantità appropriata di ogni componente sia presente nel numero giusto. Il ciclo si si può dividere in due parti generali: 1) l'infezione precoce descrive il periodo dell'ingresso del DNA all'inizio della sua replicazione e 2) l'infezione tardiva che definisce il periodo dall'inizio della replicazione al passaggio finale della lisi della cellula batterica per rilasciare le particelle fagiche figlie. Quindi, la fase precoce è dedicata alla produzione di enzimi coinvolti nella riproduzione del DNA, che comprendono quelli che riguardano la sintesi, la ricombinazione e talvolta la modificazione del DNA. Mentre, durante la fase tardiva vengono sintetizzati i componenti proteici della particella fagica. Comunque, il ciclo litico è sotto controllo positivo e ciascun gruppo di geni del fago può essere espresso soltanto quando viene dato un segnale appropriato dando luogo ad una cascata trascrizionale. Il primo stadio di espressione genica comporta l''espressione, grazie alla RNA polimerasi dell'ospite, di pochi geni i cui promotori sono indistinguibili da quelli dei geni dell'ospite. Il nome di questa classe di geni dipende dal fago, ma nella maggior parte dei casi sono noti come geni precoci. Nel fago lambda, hanno il nome di precoci immediati. Indipendentemente dal nome, uno di questi geni codifica sempre per una proteina necessaria per la trascrizione della classe successiva di geni (questa è la loro funzione principale). Questa seconda classe di geni prende nomi diversi come precoce ritardata o intermedia e la sua espressione inizia di solito non appena diventa disponibile la proteina regolatrice codificata dai geni precoci, e codificano per enzimi necessari per la replicazione del DNA fagico. Quando inizia la replicazione del DNA del fago, è giunto, invece, il momento di esprimere i geni tardivi, la cui trascrizione a questo stadio è di solito regolata dalla presenza di un ulteriore gene regolatore nella serie precedente di geni, e codificano per le componenti proteiche del fago. Questo fattore può essere un fattore antiterminazione (come nel fago lambda) o può essere un fattore sigma.
Come abbiamo visto, a tutti gli stadi di espressione del fago, uno o più geni attivi sono regolatori necessari per lo stadio successivo. Il regolatore può prendere la forma di una nuova RNA polimerasi, di un fattore sigma che modifica la specificità dell'RNA polimerasi dell'ospite, o di un fattore antiterminazione che permette alla polimerasi di leggere un nuovo gruppo di geni. Nei primi due casi, quindi di una nuova polimerasi e odi un fattore sigma, la caratteristica critica che distingue la nuova serie di geni è il loro possesso di promotori diversi da quelli riconosciuti in origine dall'RNA polimerasi dell'ospite. L'antiterminazione, invece, fornisce ai fagi un meccanismo alternativo per controllare il passaggio dei geni precoci allo stadio successivo di espressione genica. L'uso dell'antiterminazione dipende da una disposizione particolare dei geni. I geni precoci, infatti, si trovano adiacenti ai geni che devono essere espressi nello stadio successivo, ma ne sono separati da siti terminatori. Se viene impedita la terminazione a livello di questi siti, la polimerasi legge attraverso i terminatori continuando nei geni che si trovano sull'altro lato. Quindi nell'antiterminazione, gli stessi promotori continuano a essere riconosciuti dalla RNA polimerasi e i nuovi geni sono espressi semplicemente estendendo la catena di RNA per formare molecole che contengono all'estremità 5' le sequenze dei geni precoci e all'estremità 3' le sequenze dei nuovi geni.
Uno dei circuiti a cascata più intricati è utilizzato dal fago lambda. In realtà, la cascata per lo sviluppo litico è di per sé lineare, con due regolatori, ma il circuito per il ciclo litico è intrecciato con il circuito che stabilisce la lisogenia. Il DNA del fago λ è caratterizzato da un genoma di 50 kb, quindi circa 50 geni, e quando entra in una cellula ospite, la via litica e quella lisogena iniziano nello stesso modo. Entrambe richiedono l'espressione dei geni precoci immediati e precoci ritardati, ma poi divergono: lo sviluppo litico prosegue se vengono espressi i geni tardivi, mentre si instaura lisogenia se si stabilisce la sintesi del repressore. In fago λ ha soltanto due geni precoci immediati, trascritti dall'RNA polimerasi dell'ospite: 1) N codifica per un fattore antiterminazione la cui azione a livello di particolari siti permetta alla trascrizione di procedere nei geni precoci ritardati, mentre, 2) cro ha due funzioni: impedisce la sintesi del repressore (un'azione necessaria se deve procedere il ciclo litico) e spegne l'espressione dei geni precoci immediati (che non sono necessari successivamente nel ciclo litico). I geni precoci ritardati, invece, comprendono due geni di replicazione, sette geni di ricombinazione e tre regolatori. I regolatori hanno funzioni opposte. La coppia cII-cIII di regolatori è necessaria per stabilire la sintesi del repressore, mentre, il regolatore Q è un fattore antiterminazione che permette alla RNA polimerasi dell'ospite di trascrivere i geni tardivi. Quindi, possiamo dire, che alcuni geni precoci ritardati sono responsabili della lisogenia e altri del ciclo litico. In dettaglio, dobbiamo dire che, la regione interessata quindi contiene due geni (cI e cro) e tre promotori (PR, PL e PRM). Tutti gli altri geni fagici si trovano all'esterno di questa regione e sono trascritti direttamente da PR e PL (rispettivamente, il promotore di destra e quello di sinistra). PRM (il promotore per il mantenimento del repressore) trascrive soltanto il gene cI. I promotori PR e PL sono forti e costitutivi, ovvero legano con efficienza l'RNA polimerasi e permettono la trascrizione senza l'ausilio di un attivatore. PRM, invece, è un promotore debole che permette un'efficiente trascrizione solamente quando un attivatore è legato subito a monte. Quindi possiamo dire che si ha crescita litica quando i promotori PR e PL rimangono accesi, mentre quello PRM è spento. Al contrario, la crescita lisogenica è dovuta allo spegnimento di PR e PL e l'accensione di PRM.
Come abbiamo detto, il gene cI codifica il repressore di λ, una proteina con due domini uniti da una regione flessibile. Il dominio N-terminale contiene la regione di legame al DNA (il dominio elica-giro-elica). Come per la maggior parte delle proteine che legano il DNA, il repressore di λ si lega come dimero; i siti principali per la dimerizzazione si trovano nei domini C-terminali. Un singolo dominio riconosce una sequenza di DNA di 17 bp ed ogni monomero riconosce mezzo-sito, esattamente come per il sistema lac. Comunque, nonostante il suo nome, il repressore di λ può sia attivare che reprimere la trascrizione. Quando funziona da repressore si lega ai siti che si sovrappongono al promotore escludendo l'RNA polimerasi. Invece, come attivatore funziona, come CAP, per reclutamento. Sia il repressore di λ che Cro (comunque anch'essa un repressore), quindi le due proteine regolatrici che abbiamo incontrato, possono legarsi a uno di sei diversi operatori. Ciascuna di queste proteine riconosce tali siti con diversa affinità. Tre siti si trovano nella regione di controllo di sinistra e gli altri tre in quella di destra. In maniera analoga a quelli di sinistra, i tre siti di legame sull'operatore di destra sono chiamati OR1, OR2 e OR3; questi siti sono tra di loro simili in quanto a sequenza ma non identici, e ciascuno di questi, può legare dia un dimero di repressore che uno di Cro. Queste interazioni sono dotate però di diversa affinità. In particolare, è necessaria una concentrazione  di repressore dieci volte maggiore per legare OR2 rispetto a OR1. OR3 lega il repressore con la stessa affinità di OR2. Questo legame cooperativo delle proteine regolative viene usato per assicurare che i cambiamenti nei livelli di espressione di un dato gene possano essere notevoli anche in risposta a piccoli cambiamenti nei livelli del segnale che controlla quel gene. Quindi per capire come avviene la crescita litica e quella lisogena possiamo dire che: per la crescita litica un solo dimero di Cro è legato ad OR3; questo sito si sovrappone a PRM e quindi Cro reprime quel promotore. Quindi dal momento che né il repressore né Cro sono legati ad OR1 e OR2, PR lega l'RNA polimerasi e dirige la trascrizione dei geni litici; PL funziona nello stesso modo. Nella lisogenia, PRM è acceso mentre PR e PL sono spenti. Il repressore legato in modo cooperativo ad OR1 e OR2 blocca il legame dell'RNA polimerasi a PR, inibendo la trascrizione di quel promotore. Ma il repressore legato ad OR2 attiva la trascrizione da PRM.
Finora abbiamo visto come il repressore λ e Cro regolano la crescita litica e quella lisogena e come si passi sa una all'altra in seguito ad induzione. Ora ci interesseremo degli eventi immediatamente successivi all'infezione, quelli che principalmente determinano quale strada imbocchi il fago. In questa scelta sono determinanti i prodotti di due altri geni, cII e cIII. Il primo si trova sulla destra di cI ed è trascritto da PR; cIII, mentre, è a sinistra di cI e la sua trascrizione deriva da PL. In dettaglio, CII è un attivatore trascrizionale, si lega ad un sito a monte di un promotore detto PRE (per repressor estabilishment, mantenimento del repressore) e stimola la trascrizione del gene cI (il repressore) da quel promotore. Quindi il gene che codifica per il repressore può essere trascritto da due diversi promotori (PR e PRE). Soltanto quando PRE ha portato alla produzione di una sufficiente quantità di repressore, quest'ultimo si può legare ad OR1 e OR2 e promuovere la propria sintesi da PRM. Quindi vediamo come la sintesi del repressore sia iniziata da un promotore (stimolato da un attivatore) per poi essere mantenuta da un altro promotore (controllato dal repressore stesso). Riassumendo, possiamo ora considerare come CII diriga la scelta tra sviluppo litico e lisogeno. In seguito all'infezione, la trascrizione parte immediatamente dai due promotori costitutivi PR e PL. PR guida la sintesi sia di Cro che di CII. L'espressione di Cro favorisce lo sviluppo litico: una volta che la quantità di Cro avrà raggiunto un certo livello, esso legherà OR3 e bloccherà PRM. Dall'altro lato, l'espressione di CII favorisce la crescita lisogenica, promuovendo la trascrizione del gene del repressore. Per l'instaurarsi della lisogenia, il repressore deve, quindi legarsi ad OR1 e OR2 ed attivare PRM prima che Cro possa inibire quel promotore.
Ricapitolando, quando il fago infetta una popolazione di cellule batteriche sane ed in crescita vigorosa tende a propagarsi in modo litico, rilasciando la progenie in un ambiente in cui abbondano nuove cellule ospiti. Invece, quando le condizioni di crescita per i batteri sono povere, è più probabile che il fago dia origine a dei lisogeni che si inserisca nell'ospite stabilmente; infatti, probabilmente nelle vicinanze della progenie fagica vi saranno poche cellule da infettare. Queste diverse condizioni di crescita influenzano CII. In E. coli, CII è una proteina molto instabile e viene degradata da una specifica proteasi detta FtsH (HflB), codificata dal gene hfl. Le cellule prive di quest'ultimo gene, in seguito all'infezione di λ, danno quasi sempre origine a lisogeni: in assenza della proteasi, CII è stabile e dirige la sintesi di una grande quantità di repressore. Invece, se la crescita è buona, FtsH è molto attivo, CII subisce un'efficiente proteolisi, il repressore non viene sintetizzato e il fago tende a crescere in modo litico. In condizioni di scarsa crescita avviene l'opposto: una bassa attività di FtsH, una lenta degradazione di CII, l'accumulo del repressore e la tendenza all'instaurarsi della lisogenia.
Nello sviluppo di λ troviamo altri esempi di regolazione che iniziano con un meccanismo di regolazione trascrizionale positivo chiamato antiterminazione. I due geni precoci immediati N e cro, sono trascritti dall'RNA polimerasi dell'ospite. N è trascritto verso sinistra e cro verso destra ed entrambi i trascritti terminano alla fine del gene. pN è il regolatore che permette di continuare la trascrizione nei geni precoci ritardati ed è un fattore antiterminazione che sopprime l'uso dei terminatori tL e tR. In presenza di pN, la trascrizione continua alla sinistra di N nei geni di ricombinazione e alla destra di cro nei geni di replicazione.