La regolazione dell'inizio di trascrizione: alcuni esempi nei batteri

I tre geni lac, lacZ, lacY e lacA sono adiacenti uno all'altro nel genoma di E.coli, sono implicati nel metabolismo del lattosio e nel loro insieme sono definiti operone lac (operone: è un'unità di regolazione ed espressione genica composta da geni strutturali e da elementi di controllo nel DNA, che vengono riconosciuti dal prodotto di un gene regolatore). Il promotore lac, posizionato all'estremità 5' di lacZ, dirige la trascrizione di tutti e tre i geni in un unico mRNA (detto messaggio policistronico perché comprende più di un gene).
Questo mRNA viene tradotto in tre prodotti proteici. Il gene lacZ codifica per l'enzima β-galattosidasi che scinde lo zucchero lattosio in galattosio e glucosio, usati dalle cellule come fonte di energia. Il gene lacY codifica per la permeasi del lattosio, una proteina che si inserisce nella membrana cellulare e trasporta il lattosio nella cellula. Il gene lacA, invece, codifica per la tiogalattoside transacetilasi, che libera la cellula dai tiogalattosidi tossici che vengono anch'essi importati da lacY. Questi geni sono espressi ad un livello elevato solo quando il lattosio è disponibile, mentre non è presente il glucosio, che rappresenta la fonte energetica preferenziale. I batteri devono rispondere rapidamente ai cambiamenti del loro ambiente. Infatti, fluttuazioni nel rifornimento di sostanze nutrienti possono verificarsi in ogni momento e la sopravvivenza dipende dalla capacità di passare dal metabolismo di un substrato ad un altro. La sintesi si enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico si chiama induzione. Questo tipo di regolazione è molto diffuso nei batteri e si trova anche negli eucarioti unicellulari, come i lieviti. Ad esempio, quando si fanno crescere cellule di E. coli in assenza di un β-galattoside, non c'è bisogno di β-galattosidasi e i batteri contengono pochissime molecole dell'enzima, diciamo 5. Quando si aggiunge un substrato adatto, l'attività enzimatica compare molto rapidamente e nel giro di 2-3 minuti è presente una certa quantità di enzima che sale rapidamente a circa 5000 molecole per batterio. Se il substrato viene rimosso dal mezzo, la sintesi dell'enzima si blocca con la stessa rapidità con cui era stata indotta. Il controllo della trascrizione di lac risponde molto rapidamente all'induttore. Infatti, in assenza di induttore, l'operone è trascritto, come dicevamo, ad un livello basale molto basso, ma la trascrizione è stimolata non appena si aggiunge l'induttore e la quantità di mRNA lac aumenta rapidamente ad un livello indotto che riflette un equilibrio fra sintesi e degradazione dell'mRNA.  Comunque, due proteine regolative sono coinvolte in questo processo: una è un attivatore detto CAP, l'altra un repressore chiamato repressore Lac. Quest'ultimo è codificato dal gene lacI, posizionato vicino agli altri geni lac, ma trascritto a partire da un proprio promotore, invece, CAP viene codificato da un altro gene che si trova altrove sul cromosoma batterico, dunque non associato ai geni lac. Comunque, entrambi queste proteine si legano al DNA ad uno specifico sito o al promotore lac o nelle sue vicinanze, e rispondono a segnali ambientali. In particolare CAP trasmette la presenza di glucosio, mentre il repressore Lac trasmette il segnale del lattosio. Questo sistema regolativo lavora nel seguente modo: il repressore Lac può legare il DNA e reprimere la trascrizione solo in assenza del lattosio; in presenza di questo zucchero, invece, il repressore è inattivo ed i geni de-repressi (espressi). CAP può legare il DNA e inattivare i geni lac solo in assenza di glucosio. L'effetto combinato di questi due regolatori, quindi, è che i geni siano espressi a livelli elevati solo quando il lattosio è presente e il glucosio assente.
Il sito legato dal repressore Lac si chiama operatore lac, è una sequenza di 21 bp ed ha un doppio asse di simmetria ed è riconosciuta da due subunità del repressore Lac, ciascuna delle quali si lega ad una delle metà. L'operatore lac si sovrappone al promotore e, quindi, il repressore legato all'operatore impedisce fisicamente all'RNA polimerasi di legarsi al promotore ed iniziare la sintesi di RNA. La proteina CAP, invece, si lega come dimero ad un sito di lunghezza simile a quella dell'operatore lac, ma con sequenza diversa. Questo sito si trova a circa 60 bp a monte dell'inizio della trascrizione. Quando l'attivatore CAP si lega a questo sito, favorisce il legame della polimerasi al promotore sia interagendo con essa che reclutandola sul promotore. Questo legame cooperativo stabilizza il legame dell'enzima al promotore. Diversi esperimenti supportano questo modello secondo cui CAP attiva i geni lac mediante un semplice reclutamento della RNA polimerasi. Sono state isolate delle versioni mutanti di CAP che legano il DNA ma non attivano la trascrizione. Questi mutanti sono caratterizzati da sostituzioni amminoacidiche nel dominio C-terminale (CTD) della subunità α dell'RNA polimerasi. Come abbiamo visto, questo dominio è unito al dominio N-terminale (NTD) di α mediante una giunzione flessibile. L'αNTD risiede nella porzione interna dell'enzima, mentre l'αCTD si estende all'esterno e lega (quando presente) l'elemento UP del promotore. Sul promotore lac, dove non c'è un elemento UP, αCTD si lega invece al CAP ed al DNA adiacente.
La proteina CAP e il repressore Lac legano il DNA per mezzo di un comune motivo strutturale. In un tipico caso, la proteina si lega come omodimero ad un sito che corrisponde (o è simile) ad una ripetizione invertita. Ogni monomero lega una metà del sito, con l'asse di simmetria del dimero che giace sopa a quella del sito di legame. Il riconoscimento delle specifiche sequenze di DNA è mediato da una struttura secondaria conservata, nota come elica-giro-elica. Questo dominio consta di due α-eliche, una delle quali, l'elica di riconoscimento, s'insinua nel solco maggiore del DNA. I contatti presi tra le catene laterali degli amminoacidi che protrudono dall'elica di riconoscimento e le parti più esterne delle basi possono essere mediati da legami idrogeno diretti, legami idrogeno indiretti o forze di van der Waals. La seconda elica del dominio elica-giro-elica, invece, attraversa il solco maggiore e prende contatto con lo scheletro del DNA, assicurando, in questo modo, una corretta presentazione dell'elica di riconoscimento e, nello stesso tempo, aggiungendo energia di legame all'interazione proteina-DNA nel suo complesso. Questa descrizione è di fatto valida non solo per CAP e il repressore Lac, ma anche per molti altri regolatori batterici, tra i quali il repressore del fago λ e le proteine Cro. Comunque, il repressore Lac si lega come tetramero e non come dimero. Ciò nonostante ogni operatore è contattato da solo due di queste subunità- Infatti, gli altri due monomeri del tetramero possono legare uno degli altri due operatori lac, posizionati, rispettivamente, 400 bp a valle e 90 bp a monte dell'operatore principali. In questi casi, il DNA compreso tra i due siti forma un loop per consentire la reazione.
Come abbiamo detto, il componente che risponde all'induttore nel sistema lacZYA è il repressore codificato da lacI, repressore Lac. Lo stato di questo repressore determina se il promotore deve essere acceso o spento. Infatti, in assenza di un induttore, i geni non sono trascritti, perché il repressore è in forma attiva legata all'operatore. Mentre, quando si aggiunge un induttore, il repressore è convertito in una forma inattiva che si stacca dall'operatore. Quindi la trascrizione inizia a livello del promotore e procede attraverso i geni  fino ad un terminatore posto oltre l'estremità 3' di lacA. Le caratteristiche cruciali del circuito di controllo si trovano nella duplice proprietà del repressore: può impedire a trascrizione e può riconoscere il piccolo induttore. Il repressore ha due siti di legame, uno per l'operatore e uno per l'induttore. Quando l'induttore si lega al suo sito, modifica la conformazione della proteina in modo tale da influenzare l'attività del sito di legame all'operatore. Questa induzione svolge una regolazione coordinata: tutti i geni sono espressi (o non espressi) all'unisono. In dettaglio, l’induttore agisce legandosi al repressore e causando il suo distacco dall’operatore.
L’induttore può essere il substrato stesso o un suo derivato (nel caso dell’operone lac un induttore è l’allolattosio, un isomero del lattosio), ma anche altre molecole possono funzionare da induttore. Infatti, quando il lattosio entra nelle cellule, viene convertito in allolattosio. Ed è proprio questo che controlla il repressore Lac. L'allolattosio si lega al repressore Lac e induce un cambiamento nella conformazione della proteina. In assenza di allolattosio, il repressore è presente in una forma capace di legare il proprio sito di riconoscimento sul DNA, e quindi di mantenere i geni lac spenti. Una volta che l'allolattosio ha cambiato la forma del repressore, la proteina non può più legare il DNA e quindi i geni lac non sono più repressi. Un meccanismo simile regola l'attività della proteina CAP (detta anche CRP). Il glucosio abbassa la concentrazione intracellulare di una piccola molecola, il cAMP. Quest'ultimo è l'effettore allosterico del CAP: la proteina CAP solo quando è complessata con il cAMP adotta una conformazione in grado di legare il DNA. Quindi, CAP lega il DNA e attiva i geni lac solo quando i livelli di glucosio sono bassi (e quelli di cAMP alti). La porzione del CAP che lega l'effettore, il cAMP, è diversa da quella che lega il DNA. Infatti, il CAP si lega ad una regione del DNA di circa 22 bp con due pentameri di riconoscimento non ugualmente conservati. Comunque, CAP influenza l’espressione di più di 100 geni in E. coli. Il sito di legame di CAP si trova in punti diversi rispetto al sito d’inizio della trascrizione. In gal è a -41, mentre in lac è a -61. La dipendenza da CAP è correlata all’efficienza intrinseca del promotore. Nessun promotore CAP dipendente ha una buona sequenza -35 e spesso neanche una buona sequenza -10.
Infine, bisogna dire che, i componenti del circuito regolatore dell'operone si dividono in due classi e possono essere identificati in base a mutazioni che influenzano l'espressione di tutti i geni strutturale e mappano al di fuori di essi. Il promotore e l'operatore sono identificati come bersagli delle proteine regolatrici (rispettivamente RNA polimerasi e repressore) in base a mutazioni cis-agenti e il locus lacI è identificato come il gene che codifica per il repressore proteico in base a mutazioni che eliminano il prodotto trans-agente. L'operatore è stato identificato in origine in base a mutazioni costitutive (che non rispondono più alla regolazione), denotate Oc, le cui proprietà distintive hanno fornito la prima prova di un elemento che funziona senza essere rappresentato in un prodotto diffusibile. I geni strutturali contigui a una mutazione Oc sono espressi costitutivamente perché la mutazione cambia l'operatore in modo che il repressore non può più legarvisi e non può, quindi, impedire alla RNA polimerasi di iniziare la trascrizione. Quindi i mutanti Oc sono cis-agenti perché controllano un sito fisicamente continuo. Una trascrizione costitutiva è causata anche da mutazioni del tipo lacI-, che sono causate da perdita di funzione. Quando il repressore è inattivo o assente, la trascrizione può iniziare a livello del promotore. Quindi i mutanti lacI- esprimono i geni strutturali in continuazione (costitutivamente), indipendentemente dalla presenza o dall'assenza dell'induttore, perché il repressore è inattivo.
Bisogna ricordarsi che è la subunità σ della RNA polimerasi che riconosce le sequenze di un promotore. L'RNA polimerasi contenente la subunità σ70 riconosce il promotore lac, precedentemente discusso, così come la maggior parte degli altri promotori di E.coli. Questo batterio però codifica per molte altre subunità σ che, in alcune circostanze, si possono sostituire a  σ70, dirigendo la RNA polimerasi su promotori alternativi. Uno di questi fattori σ alternativi è dato dal fattore σ inducibile al calore, σ32, che aumenta quando le cellule di E. coli vengono sottoposte ad uno shock termico e permette la trascrizione di geni che proteggono la cellula da questo cambiamento ambientale. Talvolta una serie di σ alternativi permette un particolare programma di espressione genica. Nel batterio B. subtilis ne troviamo due tipici esempi. Il batteriofago SPO1 infetta questo batterio e lì cresce secondo il ciclo litico a dare la progenie fagica. Questo processo richiede che il fago esprima i propri geni in modo estremamente controllato. Tale controllo è imposto dalla polimerasi per mezzo di una serie di fattori σ alternativi. In seguito all'infezione, la RNA polimerasi batterica, contenente σ70, riconosce i così detti promotori fagici precoci che codificano per delle proteine necessarie nei primi momenti dell'infezione. Uno di questi geni, chiamato gene 28, codifica per un fattore σ alternativo. Quest'ultimo prende il posto del fattore σ batterico e dirige la polimerasi su una seconda serie di promotori del genoma fagico, quelli associati ai geni chiamati “intermedi”. A sua volta uno di questi codifica il fattore σ necessario ai geni virali “tardivi”.
Sebbene la maggior parte degli attivatori lavori per reclutamento, vi sono alcune eccezioni. NtrC e MerR rappresentano due esempi di attivatori che non funzionano tramite reclutamento, ma per mezzo di meccanismi di allosteria. Gli attivatori che lavorano per mezzo di reclutamento non fanno altro che portare una forma attiva di RNA polimerasi sul promotore. Nel caso degli attivatori che funzionano per mezzo di meccanismi allosterici, la polimerasi inizialmente lega il promotore in un complesso inattivo. Per stimolare la trascrizione, l'attivatore induce nel complesso un cambiamento conformazionale. NtrC controlla l'espressione di geni coinvolti nel metabolismo dell'azoto, come il gene glnA. Su questo gene, l'RNA polimerasi è pre-legata al promotore, in un complesso chiuso stabile. L'attivatore NtrC induce un cambiamento conformazionale nell'enzima, inducendo la transizione a complesso aperto. Come per il CAP, NtrC possiede due domini distinti per l'attivazione e il legame al DNA e lega il DNA solo in presenza di uno specifico segnale, in questo caso bassi livelli di azoto. NtrC viene fosforilato da una chinasi subendo un cambiamento conformazionale che espone il dominio di legame al DNA dell'attivatore. Una volta attivo, NtrC lega quattro siti a monte del promotore e interagisce direttamente con il fattore σ54 presente nella RNA polimerasi. Per permettere questa interazione è necessaria la formazione di un loop del DNA compreso tra i siti di legame dell'attivatore ed il promotore. Lo stesso NtrC, a questo punto, dotato di un'attività ATPasica, fornisce l'energia necessaria per il cambiamento conformazionale dell'RNA polimerasi in complesso attivo ed aperto, che porta l'enzima a trascrivere.
MerR, invece, controlla un gene denominato merT, che codifica per un enzima che rende le cellule resistenti agli effetti tossici del mercurio. Come NtrC, MerR induce un cambiamento conformazionale che porta alla formazione del complesso aperto. In questo caso, però, l'effetto allosterico dell'attivatore viene esercitato sul DNA invece che sull'RNA polimerasi. In dettaglio, MerR attiva il gene merT quando, in presenza di mercurio, si lega ad una sola sequenza di riconoscimento situata tra le regioni -10 e -35 del promotore merT, e opposta al sito di legame per l'RNA polimerasi che quindi può legarsi. Siccome gli elementi -10 e -35 sono sono caratterizzati da un'ottimale distanza e non sono allineati vengono ruotati e si ritrovano esposti su facce diverse della doppia elica. Inoltre, il legame di MerR (in assenza di mercurio) blocca il promotore nella conformazione sfavorevole: la polimerasi si può legare, ma non in modo da poter iniziare la trascrizione. Quando, invece, la proteina MerR lega il mercurio, subisce un cambiamento conformazionale che induce il DNA del centro del promotore a ruotare. Questa distorsione riporta le regioni -10 e -35 in una disposizione in qualche modo simile a quella trovata nei promotori riconosciuti da σ70 e induce la trascrizione.
Un altro operone molto importante in E. coli è l'operone araBAD, il cui promotore è attivato in presenza di arabinosio e in assenza di glucosio, e dirige l'espressione dei geni che codificano per gli enzimi necessari al metabolismo dell'arabinosio. In questo caso due attivatori lavorano insieme: AraC e CAP. Quando l'arabinosio è presente, AraC si lega a questo zucchero e adotta una configurazione che gli permette di legarsi come dimero sul DNA, su due mezzi siti adiacenti, araI1 e araI2. Subito a monte di questi siti c'è un sito CAP: quando il glucosio non è presente, CAP si lega in questa posizione e aiuta l'attivazione. In assenza di arabinosio, i geni araBAD non sono espressi. Questo avviene perché quando non è legato all'arabinosio AraC assume una diversa conformazione e lega il DNA in modo diverso: un monomero lega ancora il sito araI1, mentre l'altro monomero lega un mezzo sito più distante, detto araO2. Dal momento che questi due mezzi siti sono distanti 149 bp, il DNA compreso forma un ansa, e quindi non si verifica alcuna attivazione.