Gli enzimi di restrizione

La maggior parte delle molecole di DNA sono molto grandi per essere manipolate, o analizzate, in laboratorio. Per questo, se dobbiamo studiare singoli geni o siti specifici del DNA, le grandi molecole che si trovano nelle cellule devono essere rotte in frammenti gestibili. Ciò si ottiene mediante l'uso di endonucleasi di restrizione. Esse sono nucleasi che tagliano il DNA in siti particolari, riconoscendo sequenze specifiche. Gli enzimi di restrizione usati in biologia molecolare riconoscono brevi sequenze bersaglio (4-8 bp), normalmente palindromiche (ad esempio GAATTC-CTTAAG), e tagliano in posizioni definite all'interno di esse. Prendiamo, ad esempio, in considerazione uno degli enzimi più comunemente usati, EcoRI, così chiamato perché venne scoperto in alcuni ceppi di Escherichia coli, e fu il primo ad essere scoperto in questa specie. Esso riconosce e taglia la sequenza 5'-GAATTC-3'. Questa sequenza esomerica si ritrova mediamente ogni 4 kb. Si consideri, ora, una molecola di DNA lineare con sei copie della sequenza riconosciuta dall'enzima: EcoRI la taglierebbe in sette frammenti, le cui dimensioni dipendono dalla distribuzione dei siti nella sequenza. Si supponga che il DNA tagliato da EcoRI venga sottoposto a elettroforesi su gel: i sette frammenti si separerebbero sulla base delle loro dimensioni. Pertanto, l'enzima di restrizione ha tagliato il DNA in frammenti specifici, ciascuno corrispondente ad una regione particolare della molecola. Se la stessa molecola di DNA venisse tagliata da un enzima di restrizione diverso, che riconosce anch'esso un bersaglio di 6 bp, ma di sequenza differente, la molecola darebbe tagliata in posizioni diverse, generando frammenti di dimensioni differenti. Comunque, gli enzimi di restrizione non si differenziano solo per la specificità e la lunghezza delle sequenze di riconoscimento, ma anche per il tipo di estremità del DNA che essi generano. Alcuni enzimi generano estremità piatte, altri invece, come lo stesso EcoRI, generano estremità sfalsate. Quest'ultime risultano essere complementari tra di loro e vengono dette “appiccicose” (sticky), perché si riuniscono prontamente mediante l'appaiamento delle basi, tra loro, sulla stessa molecola, o su molecole diverse tagliate con lo steso enzima. Questa è una proprietà importante per il clonaggio del DNA. Comunque, gli enzimi di restrizione vengono classificati comunemente in tre classi: 1) gli enzimi di restrizione di tipo I: attività di riconoscimento, metilazione e taglio contenute
in un singolo enzima. Taglio anche a 1000 bp di distanza; 2) gli enzimi di restrizione di tipo II: due enzimi distinti per le attività di metilazione e taglio, riconoscono la stessa sequenza palindromica; e 3) gli enzimi di restrizione di tipo III: singolo enzima con due subunità di metilazione e taglio, taglio effettuato a 24-26 bp di distanza.
Per capire meglio come funzionano gli enzimi di restrizione basta capire come funziona il loro meccanismo ad esempio nei batteri e nei fagi. Come sappiamo, i batteri hanno un singolo cromosoma, e possono avere diversi plasmidi, in cui si trovano un origine di replicazione e geni utili per la resistenza a qualche antibiotico. I fagi, invece, sono dei parassiti del batterio che sfruttano il meccanismo biosintetico del batterio stesso, per potersi replicare e quindi per produrre progenie fagica. Se costruiamo una colonia batterica di E. coli e successivamente la iniettiamo con particolari fagi, come il fago λ, otterremo delle placche di lisi, in cui i batteri sono stati uccisi per la produzione della progenie fagica. Gli enzimi di restrizione sono stati scoperti grazie a due ceppi di Escherichia coli: il ceppo B e quello K. Il primo, infettato dal fago λ, presentava numerose placche di lisi e il fago produceva senza nessun problema la sua progenie. Se però fagi prodotti sul ceppo B, venivano utilizzati per infettare il ceppo K, quest'ultimo mostrava una resistenza all'infezione (1 colonia su 10000). A questo punto isolando i fagi sul ceppo K, si vide che era in grado di formare un gran numero di colonie sul ceppo K ma non su quello B. Quindi si pensò che la crescita su un particolare ceppo restringe la sua capacità di infettare. Infatti, se il fago inietta il suo DNA nel batterio, il macchinario biosintetico e gli enzimi di restrizione lo riconoscono tagliandolo, facendo sì che il fago non sia più in grado di riprodursi. Questi enzimi tagliano solo il DNA fagico poiché il DNA batterico è metilato e non può essere riconosciuto. A volte però può risultare metilato anche il DNA fagico (1 colonia su 10000). Comunque, oltre agli enzimi di restrizione, in biologia molecolare vengono utilizzati molti altri enzimi come: le nucleasi, enzimi che tagliano o degradano gli acidi nucleici, le ligasi, enzimi che uniscono molecole di acidi nucleici utilizzando ATP (la reazione opposta degli enzimi di restrizione), le polimerasi, che sintetizzano DNA (o RNA) su stampo di DNA (o RNA) in presenza di un gruppo 3'-OH, le fosfatasi, che rimuovono il gruppo fosfato all’estremità 5' del DNA e le polynucleotide kinase, enzima che inserisce un gruppo fosfato all’estremità 5'-OH di un acido nucleico e viene spesso utilizzato per marcare radioattivamente un'estremità del DNA. I sistemi di marcatura e tutte queste tecniche hanno permesso di analizzare ma anche di creare nuove molecole di DNA. Ad esempio, se tagliamo con EcoRI possiamo unire la molecola originale di DNA (che mancherà di un segmento), oppure due molecole diverse attraverso l'uso di ligasi. Inoltre, se tagliamo un plasmide e una molecola di DNA circolare batterico con lo stesso enzima di restrizione possiamo inserire il gene all'interno del plasmide. A questo punto, per creare grandi quantità del plasmide da noi creato possiamo mettere i batteri in coltura con diversi antibiotici, per far sì che crescano solo i microrganismi contenenti il nostro plasmide, che porterà la resistenza per qualche antibiotico.