Studio dei meccanismi di resistenza ad inibitori dell'EGFR

Il cancro del polmone è la forma di neoplasia caratterizzata dal più alto tasso di mortalità.
La carcinogenesi del tumore al polmone è un processo multifasico, spesso guidato da danni genetici ed epigenetici causati dall’esposizione cronica a carcinogeni ambientali. In questo processo sono coinvolte tre classi di geni cellulari: proto-oncogeni, geni onco-soppressori e geni i cui prodotti sono coinvolti nel riparo del DNA. Tra i proto-oncogeni hanno molta importanza le proteine ad attività tirosina-chinasica (RTK): esse sono componenti critiche delle vie che controllano la proliferazione cellulare e la differenziazione; la loro funzione è quella di catalizzare il trasferimento di γ-fosfato dall’ATP al gruppo ossidrile di residui di tirosina di proteine bersaglio. La famiglia dei RTK include il recettore dell’insulina e i recettori di molti fattori di crescita come il fattore di crescita epidermico (EGF), quello derivato da piastrine (PDGF), quello dei fibroblasti (FGF) e il fattore di crescita neuronale (Bennasroune et al. 2004).
Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR; HER1; Erb-B1) è spesso mutato o iperespresso in molti tumori umani, fra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). L’attivazione della cascata del segnale dell’EGFR ha molti effetti che comprendono l’aumento della proliferazione e dell’angiogenesi, ed una diminuita apoptosi. Questi effetti sono mediati da una serie complessa di meccanismi, come l’attivazione delle proteine chinasi attivate da mitogeni (MAPK) e la via della proteina serina/treonina chinasi B (Arteaga C.L. 2002).
EGFR è spesso iperespressa o deregolata nei NSCLC: per questo motivo vari studi si sono concentrati su questo bersaglio nel tentativo di sviluppare molecole in grado di inibirne l’attività. Negli ultimi 10 anni sono stati sintetizzati un centinaio di composti in grado di inibire l’attività delle tirosina-chinasi tra cui il Gefitinib (Iressa, ZD1839). Questo composto ad attività citostatica è un potente inibitore dell’ attività chinasica con un alto grado di selettività per l’EGFR rispetto ad altri membri della famiglia ErbB ed altre chinasi.
Scopo di questa tesi è stato quello di verificare la sensibilità all’Iressa in un pannello di 11 linee di carcinoma polmonare (H460, A549, Calu-1, Calu-3, SKMES-1, SKLU-1, Lx-1, H520, H1650, H1299, H596) e una linea di carcinoma epidermoide di vulva (A431) che ha, come riportato da dati in letteratura (Janmaat et al., 2003), un livello molto elevato di espressione dell’EGFR e un’alta sensibilità all’Iressa.
A questo scopo sono stati inizialmente quantificati i livelli di EGFR, di EGFR fosforilato in maniera costitutiva, di PTEN e di p53 in tutte le linee cellulari; successivamente è stata valutata la sensibilità all’Iressa mediante un saggio di vitalità (MTS).
Sono state quindi scelte 3 linee cellulari che presentano un livello di sensibilità al farmaco basso (SKLU-1), intermedio (A549) e alto (Calu-3): per ognuna è stata valutata la risposta al farmaco nel tempo.
Al fine di migliorare questo tipo di indagine si è valutata la capacità dell’Iressa di inibire la fosforilazione dell’EGFR e la conseguente attivazione della cascata del segnale di AKT e di p42/p44 MAPK nelle tre linee cellulari Calu-3, SKLU-1, A549 tramite Western blotting.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che le varie linee cellulari rispondono in maniera differente al trattamento con Iressa: tra queste le SKLU-1 si dimostrano resistenti in quanto rispondono tardivamente (dopo 48-72 ore di trattamento col farmaco), mentre la linea cellulare Calu-3 è particolarmente sensibile e risponde già dopo 16 ore di incubazione; infine il modello cellulare A549 presenta un comportamento intermedio.
La risposta al trattamento con il farmaco non è inoltre correlabile con i livelli di EGFR presenti nelle varie linee cellulari: nelle cellule Lx-1 e H520, che non esprimono l’EGFR, il farmaco è comunque efficace; questo risultato indica che sono coinvolti anche altri bersagli, per ora sconosciuti, nell’azione dell’Iressa.
Le linee di carcinoma polmonare, Calu-3, A549 e SKLU-1, scelte per determinare la capacità dell’ Iressa di inibire la fosforilazione dell’ EGFR e la conseguente attivazione delle MAP-chinasi e di AKT, mostrano una diversa sensibilità al trattamento con Iressa. Questo può essere dovuto al fatto che esprimono differenti livelli di EGFR, anche se questo parametro non è applicabile a tutti i modelli analizzati in precedenza. Inoltre nell’analisi delle due vie principali di trasduzione del segnale, la via di Akt e la via delle MAPK, non si osservano particolari differenze fra i tre modelli testati, evidenziando che la sensibilità/resistenza di tali cellule è probabilmente dovuta ad altri fattori.