Ruolo di REST nella rigenerazione muscolare

REST (Repressor Element 1 Silencing Transcription factor, anche conosciuto come Neuron-Restrictive Silencing Factor, NRSF) è un repressore della trascrizione genica ubiquitario ed è considerato un regolatore primario della neurogenesi, processo legato alla formazione di nuove cellule nervose a partire da cellule staminali neurali o da cellule progenitrici. REST è in grado di legare una sequenza conservata, denominata elemento repressivo 1 o RE1, inibendo la trascrizione di geni neuronali in cellule staminali neurali (NSCs) e in cellule non neuronali. La sequenza RE1, infatti, è localizzata nei promotori di molti geni neuronali; REST è in grado di formare un complesso di repressione trascrizionale con due cofattori, CoREST e mSin3. È, inoltre, associato a diversi enzimi responsabili di modificazioni istoniche, tra i quali le istone-deacetilasi (HDACs). Molti lavori hanno dimostrato che le HDACs interagiscono con il complesso di REST per esplicare una funzione repressiva, non solo a livello del sistema nervoso centrale, ma anche nel tessuto muscolare cardiaco, dove REST regola negativamente la trascrizione di molti geni cardiaci espressi durante il differenziamento, garantendo una normale funzionalità cardiaca. Gli enzimi istone-deacetilasi sono, inoltre, coinvolti nella repressione dei geni implicati nel differenziamento/rigenerazione del muscolo scheletrico attraverso l'interazione con i fattori regolatori della miogenesi MyoD e MEF2. In accordo con queste evidenze, abbiamo deciso di indagare il ruolo di REST come repressore trascrizionale nel tessuto muscolare scheletrico e il suo presunto coinvolgimento nel processo differenziativo. Abbiamo generato un modello murino knockout condizionale REST-Flox/MyoD-Cre al fine di indurre l'inibizione dell'espressione di REST specificamente a livello muscolare. Abbiamo eseguito delle analisi di western blotting su quadricipiti (QA) e tibiali anteriori (TA) di topi Cre+ REST Flox/Flox per confermare l'assenza di espressione di REST. Abbiamo, quindi, eseguito le analisi morfologiche del tessuto muscolare del topo Cre+ REST Flox/Flox paragonato al topo normale. I risultati di queste analisi hanno mostrato una riduzione del diametro delle fibre muscolari di tipo I nei topi Cre+ REST Flox/Flox, implicando la presenza di un processo di rigenerazione a livello muscolare. Successivamente, per valutare la presenza e il numero di cellule satelliti, abbiamo effettuato delle analisi di immunofluorescenza nei topi Cre+ REST Flox/Flox e abbiamo isolato ed espanso in vitro le cellule satelliti dai muscoli dei topi Cre+ REST Flox/Flox. Dai risultati si evince che il numero di cellule satelliti nel modello Cre+ REST Flox/Flox è simile a quello del topo wild-type e che quindi, in condizioni normali, l’assenza di REST non abbia alcuna influenza sul numero di cellule satelliti all’interno del muscolo. Infine, per meglio caratterizzare il processo di rigenerazione indotto dal knockout condizionale di REST, abbiamo condotto degli esperimenti di induzione di danno muscolare mediante iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX) in TA di topi Cre+ REST Flox/Flox e Cre- REST Flox/Flox. I topi sono stati sacrificati a 2, 5, 7 e 10 giorni dopo il trattamento. A 10 giorni dall’'iniezione di CTX, i muscoli Cre+ REST Flox/Flox iniettati hanno mostrato un ritardo del differenziamento delle fibre rispetto ai muscoli di topi Cre- REST Flox/Flox. Ulteriori esperimenti di immunofluorescenza sono stati condotti su sezioni di TA di topi Cre+ REST Flox/Flox in seguito a danno da CTX, per valutare il numero di cellule satelliti a 2, 5, 7 e 10 giorni dall’iniezione. Dai risultati si evince che nei topi Cre- REST Flox/Flox il pool delle cellule satelliti ha un picco massimo a due giorni dall’iniezione di CTX mentre, nei topi Cre+ REST Flox/Flox, il pool ha un picco massimo a sette giorni. Questi dati dimostrano come l’assenza di REST, in seguito a danno muscolare, porti a un ritardo nell’attivazione delle cellule satelliti rispetto ai topi controllo e quindi a uno spostamento del picco di rigenerazione nel tempo. Inoltre, la presenza di fibre immature di piccolo calibro dopo il danno muscolare che non tendono ad aumentare di diametro e ad esprimere correttamente la proteina di membrana laminina, dimostra che il repressore trascrizionale REST potrebbe essere coinvolto nel processo di differenziamento muscolare. La nostra ipotesi è che REST sia in grado di formare un complesso trascrizionale che regola il differenziamento muscolare. L'identificazione del pathway molecolare di REST potrebbe portare alla scoperta di target molecolari e quindi alla possibilità di studiare nuove e innovative terapie farmacologiche finalizzate al miglioramento dei processi di rigenerazione del muscolo scheletrico. Queste evidenze potrebbero aprire scenari futuri per il trattamento delle malattie neuromuscolari degenerative come le distrofie muscolari.