Tecnica RAPD (Random Amplification Of Polymorphic DNA)

La Polymerase Chain Reaction (PCR), reazione a catena mediata dalla DNA polimerasi, è una tecnica che ha rivoluzionato l’ingegneria genetica. Essa consiste nell’amplificazione selettiva in vitro di una piccola regione genomica delimitata da due sequenze specifiche consentendo di ottenere centinaia di migliaia di molecole identiche di DNA a partire da quantità minime di DNA di partenza (Mullis KB et al. 1986). Un prerequisito indispensabile al realizzarsi della reazione è che si conosca, almeno in parte, la sequenza della regione genomica che si vuole amplificare poiché il principio su cui si basa la PCR è che dopo aver denaturato il DNA, si fanno riassociare i filamenti singoli in presenza di un eccesso di due oligonucleotidi sintetici (primers) delimitanti la regione bersaglio dell’amplificazione. Tali oligonucleotidi, aventi una lunghezza in genere, compresa tra le 20 e le 30 paia di basi, vengono selezionati in base a diversi parametri: la temperatura media di fusione e la specificità di riconoscimento dello stampo. Inoltre è fondamentale che la sequenza di queste molecole non presenti regioni di appaiamento intermolecolari e quindi non possa formare strutture secondarie su se stessa. Gli oligonucleotidi vengono disegnati, dallo sperimentatore, in modo che i loro estremi 3’-OH fungano da innesco per la DNA polimerasi. In tal modo essa può sintetizzare un filamento di DNA complementare su ognuno dei due filamenti originari. Dato l’eccesso molare degli oligonucleotidi, i filamenti del DNA denaturato al calore, si riassoceranno quasi esclusivamente con questi piuttosto che tra di loro. Ognuno dei due filamenti di nuova sintesi si estende in direzione 5’->3’, copre il tratto di interesse, giungendo fino al tratto corrispondente all’altro oligonucleotide. Dopo un breve intervallo di tempo il DNA viene nuovamente denaturato, in modo da interrompere la polimerizzazione e, successivamente, la molecola stampo viene subito rinaturata per dare inizio ad un nuovo ciclo.Dal punto di vista applicativo, inizialmente la PCR rappresentava un'alternativa valida al clonaggio, tuttavia in seguito, con il progredire e il raffinarsi della tecnologia stessa, è diventata il punto di forza per esplorare numerosi campi scientifici ed innumerevoli sono le sue attuali applicazioni. Alcune delle principali riguardano il campo della diagnostica molecolare ma anche l’ambito forense e medico legale. In campo diagnostico, la PCR ha fornito un potente strumento per effettuare diagnosi di infezioni batteriche e virali (HIV e tubercolosi), di malattie genetiche (emofilia e distrofia muscolare di Duchenne) e tumorali (linfomi). Relativamente all’ambito forense e medico legale, la PCR si è imposta come strumento essenziale sul quale si basano analisi di paternità e perizie medico-legali ormai utilizzate comunemente a scopo probatorio nei tribunali di tutto il mondo. Un importante campo di applicazione è rappresentato dall’amplificazione di siti ipervariabili del genoma umano, dove esistono numerose regioni polimorfiche, incluse molte sequenze ripetute in tandem. Queste sequenze possono essere sfruttate per una fine tipizzazione in molti modi. Il più semplice e diffuso deriva dalla generazione di restriction fragment lenght polimirfism (RFLP) che si ottengono digerendo genomi diversi con uno o più enzimi di restrizione, spesso associati all’utilizzo di sonde marcate. I profili che si ottengono variano da individuo a individuo e sono noti come DNA fingerprinting. Una variante importante di questa tecnica consiste nella cosidetta Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD).