Ruolo dell'Hsp70 nella modulazione della sopravvivenza in cellule tumorali

L’Hsp70 è una proteina inducibile che contribuisce alla sopravvivenza cellulare in condizioni ambientali o metaboliche sfavorevoli. Il TNF è una citochina proinfiammatoria nota per la sua capacità di causare morte di cellule tumorali o trasformate. La citochina determina morte. In numerosi modelli sperimentali è stato osservato che il TNF provoca la permeabilizzazione della membrana lisosomica (LMP) e morte cellulare. L'Hsp70 stabilizza anche la membrana dei lisosomi e ne impedisce LMP causata da vari agenti, tra cui anche il TNF.
Obiettivo di questa tesi è stato: approfondire l’effetto dell’espressione dell’Hsp70 sui meccanismi di morte da TNF; verificare se il TNF causi LMP e se l’entità di quest’ultima sia correlata con l’ espressione di Hsp70; investigare se l’autofagia moduli la suscettibilità alla citochina. Infine, è stato verificato l’effetto dell’espressione dell’Hsp70 sull’LMP causata da sfingosina, uno sfingolipide risultante dal catabolismo della ceramide e noto per la sua azione permeabilizzante la membrana lisosomica. Come modello sperimentale sono state utilizzate cellule HeLa, derivate da un carcinoma della cervice uterina. In questo studio, oltre a quello parentale, sono stati utilizzati ceppi trasfettati stabilmente in modo da iperesprimere o essere privi di Hsp70.
La verifica dell’espressione dell’Hsp70 inducibile nei tre ceppi cellulari ha evidenziato che la proteina risulta moderatamente più abbondante in cellule HeLaHsp70 rispetto al ceppo d’origine, mentre in cellule HelaSil l’espressione è risultata nulla. Tutti i ceppi esprimono quantità apprezzabili degli altri membri della famiglia dell’Hsp70. Tutti i ceppi sono risultati suscettibili alla citochina, anche se la mortalità è risultata più elevata nel ceppo HeLaSil. Questo dato evidenzia, pertanto, come l’assenza di Hsp70 aumenti la suscettibilità al TNF/CHX. E’ stato poi verificato se il comparto lisosomico-vacuolare acido sia coinvolto nella morte incubando le cellule con TNF/CHX, in presenza o meno di NH4Cl, un inibitore selettivo della funzionalità lisosomica. L’inibitore ha attenuato debolmente la tossicità della citochina nel ceppo iperesprimente Hsp70, ma non in quelli WT e silenziato. Tale risultato indica come, in cellule HeLa, la tossicità da TNF/CHX non sia mediata dai lisosomi. È stata poi valutata la capacità dell’Hsp70 di proteggere la membrana lisosomica dalla permeabilizzazione indotta dal trattamento con TNF/CHX. Per verificare l’LMP, prima del trattamento con la citochina, i lisosomi sono stati marcati con arancio di acridina per evidenziare le cellule nelle quali i lisosomi hanno conservato la capacità di assumere e trattenere il colorante. È emerso per tutti i ceppi che il TNF causa LMP, che si manifesta con maggiore forza in cellule prive di Hsp70; pertanto, l’assenza di Hsp70 pare favorire il danno lisosomico da TNF. Il fatto che l’LMP si osservi anche in cellule parentali o nelle HeLaHsp70 suggerisce, invece, che l’iperespressione della proteina non sia sufficiente per preservare del tutto l’integrità della membrana lisosomica.
Successivamente è stata verificato se l’autofagia rappresentasse un meccanismo di protezione nei confronti della morte cellulare. Contrariamente a quanto osservato in numerosi altri modelli, i risultati hanno evidenziato che l’autofagia sensibilizza tutti i ceppi alla citochina, indipendentemente dal livello di espressione di Hsp70.
Le cellule sono state infine trattate con sfingosina (SPH), un potente induttore di LMP, che ha causato alterazioni morfologiche, LMP e morte in modo inversamente proporzionale alla quantità intracellulare di Hsp70. L’espressione della proteina risulta quindi importante ai fini della protezione dei lisosomi del danno lisosomico da SPH. Inoltre, anche in questo caso l’autofagia, oltre a non attenuare la morte cellulare ha aumentato la LMP.
I dati ottenuti confermano come l’espressione dell’Hsp70 moduli la suscettibilità e l’entità dell’LMP prodotte dalla citochina o altri agenti permeabilizzanti i lisosomi in cellule HeLa. La permeabilizzazione dei lisosomi e l’induzione di morte potrebbero rappresentare una strategia per indurre morte in cellule trasformate o neoplastiche. In questo contesto, l’iperespressione di Hsp70 nei tumori potrebbe condizionare la suscettibilità a farmaci dotati di questa attività e attenuare l’efficacia dei trattamenti antiblastici. La caratterizzazione preliminare e la messa a punto di strumenti molecolari per interferire con l’espressione di Hsp70, quindi, potrebbe aumentare la probabilità di successo e l’efficacia di alcuni dei farmaci antitumorali di impiego corrente.