Preparazione e impianto di costrutti genetici per il silenziamento genico

Lo scopo del presente lavoro è la messa a punto di materiali (costrutti genetici) e metodologie per la realizzazione di esperimenti di silenziamento genetico (gene silencing) transiente in foglie di vite (Vitis vinifera).
Il gene silencing è basato su un sistema di degradazione sequenza-specifica dell’ RNA, è un processo conservato in un’ampia gamma di organismi ed è chiamato PTGS (post-transcriptional gene silencing), RNAi (RNA interference) e quelling, rispettivamente in piante, animali e funghi. L’attivazione di questo sistema è innescata da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA). Le piante, in particolare, usano il silencing come sistema di difesa contro virus e RNA aberrante.
Per mettere a punto il sistema di silencing in vite, si è utilizzato come marcatore il gene che codifica per la phytoene-desaturase, un enzima coinvolto nella biosintesi dei carotenoidi a livello del cloroplasto. Il silenziamento di questo gene determina “foto-ossidazione” della clorofilla, portando alla comparsa di macchie bianche sulle foglie indicate con il nome di bleaching.
La sequenza della phytoene-desaturase è stata ricercata nella banca dati di TIGR di vite (www.tigr.org) e successivamente clonata in pENTR™/SD/D-TOPO® ( Invitrogen™), un vettore basato su un sistema di ricombinazione sito-specifica chiamato Gateway® (Invitrogen™), che permette di trasferire in modo rapido ed efficiente frammenti di DNA tra diversi vettori di clonaggio, grazie a specifiche sequenze del batteriofago lambda.
Il pENTR/PDS è stato ricombinato con pk7GWIWG2 (II) (www.psb.ugent.be), vettore binario basato sul sistema Gateway® che è in grado di replicarsi in Agrobacterium tumefaciens. Con un unico processo di ricombinazione il gene della phytoene-desaturase è stato clonato nel suddetto vettore in orientamento senso e antisenso. Una volta veicolato nel genoma della pianta questo costrutto genico viene trascritto in un RNA che, ripiegandosi su se stesso grazie alla presenza di un introne che separa le copie senso e antisenso, forma un loop ed una struttura a dsRNA in grado di sviluppare silencing con maggiore efficienza rispetto a vettori che sovraesprimono la sequenza del gene o esprimono il suo antisenso.
Con il vettore ottenuto, sono stati trasformati tre ceppi di Agrobacterium tumefaciens (AGL1, C58C1, LBA4404), che sono stati utilizzati per agroinfiltrare diversi genotipi di vite. La trasformazione con i tre diversi ceppi (tuttora in corso) ha lo scopo di individuare il ceppo più virulento nei confronti dei genotipi di vite utilizzati e di evidenziare possibili combinazioni vite-A. tumefaciens.