Analisi cromatografiche di proteine di interesse alimentare

1 1. INTRODUZIONE La purificazione di proteine di interesse alimentare dalle matrici di provenienza rappresenta un problema di cruciale importanza al fine di ottenere preparati omogenei utili per un approccio di caratterizzazione molecolare delle proteine in esame. Infatti, lo studio di parametri biochimici, enzimatici, immunologici e delle caratteristiche strutturali delle proteine molto spesso richiede un alto grado di purificazione di tali molecole. Tuttavia tale procedimento risulta alquanto difficile quando le matrici di provenienza delle proteine sono complesse come quelle alimentari quali ad esempio le farine di leguminose e l’albume dell’uovo. In commercio sono disponibili diverse preparazioni di proteine ottenute da fonti alimentari, tuttavia queste ultime risultano, nella maggior parte dei casi, solo parzialmente purificate. Tra le principali metodiche che permettono la purificazione di proteine, si ritrova la cromatografia, una tecnica di particolare importanza sia storica che applicativa. 1.1 – Cromatografia La cromatografia è una tecnica separativa, in cui i composti da separare si distribuiscono in due fasi immiscibili. Tale tecnica è utilizzata per separare molecole in base alla carica, alla massa e alla solubilità ed inoltre può separare materiali in grande quantità (parecchi grammi) o piccole quantità (picogrammi). Il processo usa una fase stazionaria, immobile, e una fase mobile che scorre sopra o attraverso la fase stazionaria. Le matrici in uso per la fase stazionaria sono selezionate per avere alta resistenza meccanica, in modo da non cambiare durante il processo, alta stabilità chimica, alta capacità e gruppi funzionali per eventuali legami con le molecole da analizzare. Le matrici più utilizzate sono di agarosio, cellulosa, poliacrilammide, silice, polistirene. La fase mobile può essere liquida o gassosa. Numerosi sono i solventi che possono essere utilizzati per la fase mobile. Generalmente il potere eluente di un solvente varia in funzione della polarità,della temperatura,della natura delle sostanze da separare. I solventi utilizzati possono essere classificati in base al potere eluente crescente: etere di petrolio, cicloesano, tetracloruro di carbonio,toluene,cloruro di metilene,cloroformio,etere etilico,acetato di etile,acetone, propanolo, etanolo, metanolo, acqua, acido acetico. Inoltre è possibile utilizzare tali solventi in miscele di varia composizione in modo tale da realizzare fasi mobili con potere eluente variabile. Le prime esperienze cromatografiche di cui si ha memoria scritta risalgono all’inizio del 1900 quando il botanico Mikhail Tswett separò pigmenti di origine vegetale utilizzando la cromatografia di adsorbimento,usando carbonato di calcio come adsorbente e una miscela di benzina e etanolo come eluente. A mano a mano che l'eluente fluiva trascinando con sé il campione, questo si separava in bande di diverso colore (da qui il nome "cromatografia"), ciascuna delle quali procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità. Agli inizi degli anni ’40 gli studiosi Martin