Costruzione di un vettore per la soppressione del gene ARH responsbile dell'ipercolesterolemia autosomica recessiva (ARH)

Il pSUPER è un nuovo tipo vettore sviluppato nell’ambito della ricerca genetica sui mammiferi. Il nostro lavoro si è incentrato sull’utilizzo di questo vettore nell’ambito di una rara malattia genetica: l’Ipercolesterolemia Autosomica Recessiva (ARH). La scoperta di questa nuova forma di ipercolesterolemia risale ai primi anni ’70 con il lavoro di Khachadurian. Dopo anni di studi è stata individuata nel 2001 la proteina difettosa responsabile di questa patologia chiamata appunto ARH. Si tratta di una proteina del recettore delle LDL. È oggi evidente che ARH riveste un ruolo cruciale nell’internalizzazione e nel catabolismo delle LDL. Inoltre ARH è una proteina ubiquitaria e presente in grande quantità. La presenza di ARH in altre cellule e la sua notevole quantità ha fatto supporre che tale proteina possa svolgere ulteriori ruoli all’interno della cellula che devono essere ancora evidenziati e che saranno oggetto di studi futuri.
L’obbiettivo di questo lavoro era quello di costruire un vettore che permettesse la soppressione dell’espressione del gene ARH in modo da poterne studiare nei dettagli la funzione e quindi poter individuare una possibile terapia.
La strategia del pSUPER è il frutto di un lungo studio sul silenziamento di geni iniziato circa 20 anni fa. Infatti dalla teoria dell’Antisenso che si rivelò poco selettivo e quindi inefficace si è passati al problema della citotossicità dei lunghi dsRNA sintetici fino ad arrivare all’effetto non tossico ma transiente degli Smaller RNA .
Nel 2002 R.Agami ideò un vettore di 3176bp ,il pSUPER, che consentiva uno stabile silenziamento dell’espressione di geni specifici in cellule di mammifero sfruttando la selettività e l’assenza di tossicità dell’RNA Interference.
Il pSUPER è un plasmide di sintesi che sfrutta il promotore della RNApolimerasi III porta la resistenza all’ampicillina e presenta siti multipli per il clonaggio. Tale vettore permette la trascrizione di piccoli RNA di 21-22bp che vengono processati per dare gli isRNA funzionali. I piccoli trascritti sono specifici per l’mRNA del gene che interessa e si appaiano con esso per dare un duplex isRNA/mRNA che viene immediatamente riconosciuto dalla cellula e degradato.
L’inserto specifico per ARH di 64bp è stato disegnato in base al protocollo suggerito dallo stesso Agami. Gli oligo sintetici ,forward e reverse, sono stati quindi sottoposti ad appaiamento per la successiva ligazione nel plasmide. I 3l di pSUPER originali gentilmente offerti dal dott.re Agami sono stati linearizzati utilizzando gli enzimi di restrizione Bgl II e Hind III come suggerito dallo stesso Agami e defosforilato con l’enzima SAP. L’inserto è stato introdotto nel pSUPER non senza difficoltà trattandosi di un inserto piccolo se paragonato alla grandezza del plasmide. Le difficoltà della ligazione ci hanno spinto a scegliere di utilizzare due strategie che prevedevano concentrazioni diverse di inserto rispetto al plasmide. Una delle due strategie ci ha permesso di ottenere 4 colonie positive alla selezione che sono state sottoposte ad analisi dopo miniprep. Il plasmide delle 4 colonie è stato digerito con Hind III e EcoRI in quanto il sito di Bgl II viene perso in seguito alla ligazione dell’inserto. Abbiamo visualizzato in questo modo la banda da 300bp prevista da Agami in caso di successo della ligazione a confronto di quella da 250bp del plasmide vuoto. Abbiamo inoltre effettuato una controprova avviando una digestione con Bgl II che ha confermato l’effettiva assenza di tale sito enzimatico. I 4 pSUPER sono stati amplificati e purificati mediante midiprep per essere utilizzati nella trasfezione in cellule epatiche HepG2.