Misura degli idroperossidi lipidici nel siero mediante l'ossidazione dello ione ferro

La formazione e l’attività degli idroperossidi lipidici hanno ricevuto molta attenzione negli ultimi tempi.
La tecnica utilizzata nel nostro studio per la loro misura prevede la generazione e la determinazione di Fe3+ mediante l’uso dello xilenolo arancio, colorante capace di chelare lo ione ferrico. Gli idroperossidi lipidici ossidano selettivamente il Fe2+ in ambiente acido e lo ione ferrico risultante può essere determinato mediante il complesso ferro-colorante, alle lunghezze d’onda di 560-580 nm, come misura indiretta della concentrazione degli idroperossidi nel campione.
A fini diagnostici, la misura degli idroperossidi viene di solito eseguita sulle frazioni lipidiche delle lipoproteine a bassa densità, ottenute mediante ultracentrifugazione del siero. Le LDL, infatti, contengono la più alta percentuale di idroperossidi nella loro composizione. I tempi lunghi della preparazione delle LDL ci hanno suggerito la possibilità di determinare gli idroperossidi direttamente nel siero: ciò consentirebbe una loro misura in tempi molto brevi.
L’obiettivo della mia Tesi, quindi, è stato quello di determinare gli idroperossidi direttamente nel siero e di verificare se tale misura possa essere considerata un indice di ossidazione, come risulta per il dosaggio sulle LDL.
Nel nostro studio abbiamo utilizzato e confrontato due metodiche spettrofotometriche FOX e SAR, tuttavia poiché la misura degli idroperossidi lipidici nel siero può risultare difficoltosa, a causa della esiguità del campione da determinare, abbiamo valutato che il segnale della reazione potesse essere amplificato da una aggiunta ritardata del BHT. Infatti, il BHT utilizzato come antiossidante è stato aggiunto a tempi successivi in modo da consentire lo sviluppo della reazione a catena della perossidazione e la formazione di una maggiore quantità di Fe3+.
Il reattivo FOX utilizzato per la misura degli idroperossidi è composto da:
Xilenolo arancio - Solfato ferroso - Metanolo e Acido solforico.
Solitamente tale reattivo contiene anche il BHT; per il nostro studio abbiamo, invece, preparato una soluzione FOX contenente le sostanze citate escluso il BHT e, separatamente, una soluzione di BHT in metanolo 90%. Tale soluzione è stata aggiunta al tempo zero al campione-controllo, dopo 1,5 e 3 minuti rispettivamente al secondo e terzo campione.
Abbiamo seguito lo stesso procedimento utilizzando la nuova soluzione di lavoro messa a punto nel nostro laboratorio e composta da:
Xilenolo arancio - Solfato ferroso - Saccarosio e Acido solforico.
Dopo un periodo di incubazione di 40 minuti, per consentire lo sviluppo completo del colore, l’assorbanza viene determinata su uno spettrofotometro UV/VIS alle lunghezze d’onda di 560-580 nm.
Rappresentando le variazioni di assorbanza in funzione dell’aggiunta del BHT a tempi successivi, si osserva un andamento crescente. I valori di ABS dei campioni (che indichiamo con B e C) crescono rispetto al valore del campione controllo (che indichiamo con A) dimostrando che il segnale colorimetrico della reazione viene amplificato da una aggiunta ritardata del BHT.
I due metodi hanno dato valori di ABS notevolmente differenti: i valori del FOX vanno da circa 10 milliUnità di ABS a circa 20 mU, mentre quelli del SAR vanno da circa 210 a circa 220 mU.
Si osserva un aumento del segnale colorimetrico, dei campioni rispetto al controllo, consistente nel metodo FOX e appena accennato nel metodo SAR. I due metodi presentano, inoltre, una notevole differenza in sensibilità.
La minore sensibilità del metodo FOX è probabilmente dovuta alla presenza di solventi organici nel reattivo e all’azione “scavenger” del BHT sul radicale metanolico, che altrimenti amplificherebbe l’ossidazione dello ione ferroso. Infatti un ritardato intervento del BHT contribuisce a scatenare la reazione di ossidazione a catena negli idroperossidi lipidici.
L’esiguo aumento dell’intensità colorimetrica nel metodo SAR è probabilmente dovuto al fatto che l’amplificazione prodotta dal saccarosio è già elevata e una aggiunta ritardata del BHT non comporta un ulteriore aumento significativo del segnale.
In conclusione, il metodo SAR, sebbene non risponda in maniera evidente all’aggiunta ritardata del BHT come il metodo FOX, dai valori di ABS ottenuti, risulta più sensibile e accurato nella determinazione degli idroperossidi lipidici nel siero totale, consentendo di ottenere in tempi brevi una misura dell’ossidazione.