Caratterizzazione e cristallizzazione di sequenze oligonucleotidiche ricche in guanina formanti quadruple eliche di DNA

Caratterizzazione e cristallizzazione di sequenze oligonucleotidiche ricche in guanina formanti quadruple eliche di DNA.
Le sequenze di DNA ricche in guanine hanno la capacità di ripiegarsi su se stesse formando quadruple eliche di DNA. Una quadrupla elica si forma grazie alla capacità delle basi di guanine di organizzarsi in unità dette G-tetradi, che consistono in un arrangiamento co-planare delle quattro basi azotate associate attraverso legami ad idrogeno Hoogsteen (vedi figura).
Le strutture a quadrupla elica hanno riscosso un notevole interesse principalmente per il loro possibile utilizzo in vivo. Infatti, le sequenze ricche in guanine sono presenti in zone del genoma umano di rilevanza biologica, ad esempio alla fine del cromosoma eucariotico come complesso telomero-proteina; in regioni promotrici e in sequenze associate a malattie umane . Oltre ad un loro potenziale ruolo biologico in vivo, l’importanza delle quadruplex in campo biomedico è stata recentemente riconosciuta per due possibili applicazioni: 1) nella terapia anticancro, 2) nella progettazione di nuovi oligonucleotidi (aptameri) che riconoscono ed inibiscono particolari proteine.
Il lavoro di tesi ha riguardato la cristallizzazione di alcuni oligonucleotidi formanti G-quadruplex allo scopo di ottenere una loro caratterizzazione strutturale ad alta risoluzione mediante diffrazione dei raggi X, in più sono stati effettuati anche studi interazione di tali sequenze con daunomicina, un antibiotico (tetraciclina) capace di stabilizzare le strutture quadruplex.
La cristallizzazione di molecole da una soluzione è un fenomeno i cui specifici parametri cinetici e termodinamici dipendono dalle proprietà chimiche e fisiche del solvente e del soluto. Cristallizzare una molecola significa ridurre lentamente la sua solubilità in modo da farla precipitare in forma cristallina, in una struttura cioè, costituita da unità minime di atomi o molecole che si ripetono tridimensionalmente in maniera ordinata e periodica. Il processo di cristallizzazione dipende da numerosi fattori quali la concentrazione della molecola da cristallizzare, il pH, la temperatura, la presenza di additivi di vario genere (sali, polimeri, solventi organici ecc..). Trovare le condizioni per ottenere cristalli di buona qualità di molecole biologiche non è semplice ed, infatti, la cristallizzazione rappresenta lo stadio lento del processo di determinazione strutturale mediante cristallografia ai raggi-X. Tuttavia, grazie ad un’attenta verifica della omogeneità conformazionale dei campioni mediante dicroismo circolare e una ricerca ampia e dettagliata delle condizioni di cristallizzazione, in questo lavoro sono riuscita a ottenere cristalli di LNA (5-(TGGGT)-3) e del complesso tra PNA-DNA (t-5’GGGGT 3’), e la daunomicina. Questi due oligonucleotidi formano entrambi strutture a quadrupla elica e sono caratterizzati dalla presenza di modifiche chimiche che li rendono più stabili e meno sensibili all’azione delle nucleasi rispetto alla sequenza non modificata, TGGGGT.