Studio sulla proteina MsmDnaB1: una nuova inteina di classe 3

Le peculiari reazioni alla base dello splicing proteico rendono le inteine preziosi strumenti per la generazione di proteine modificate. Sono state prodotte ad oggi molte inteine ingegnerizzate che hanno consentito di ottenere sia proteine modificate all’estremità C-terminale con una funzione tioesterea sia proteine che presentano in posizione N-terminale un amminoacido diverso dalla metionina.

Ad esempio, la mutazione N139A nella MxeGyrA, un’inteina di classe 1 che media reazioni di splicing veloci ed efficienti, produce un’inteina in grado di dare splicing solo all’N-terminale, producendo intermedi tioesteri.

La reazione tra peptidi (sintetici o espressi) e proteine ottenute in seguito a reazioni di splicing è nota come Expressed Protein Ligation (EPL) o anche Intein mediated protein Ligation (IPL) ed è adoggi un potentissimo strumento per le biotecnologie e la biologia molecolare (Evans TC et al. J BiolChem 1999, Severinov K. e Muir T. J BiolChem1998). Proteine tioesteri al C-terminale o con cisteina all’N terminalepossono essere utilizzate come substrati in reazioni di chemical ligation.(Tom W. Annu. Rev. Biochem. 2003).

In queste reazioni una proteina o un peptide tioestere al C-terminale si combina con una proteina/peptide con una cisteina all’N-terminale e produce un nuovo costrutto in cui i due frammenti sono legati mediante un legame peptidico nativo (Noren CJ et al. J BiolChem 2009). Tali reazioni sono impiegate per la modificazione selettiva di proteine. Ad esempio sono state utilizzate per la semisintesi di istoni modificati (Muir TW, ACS ChemBiol 2009), per la marcatura su atomi selezionati di proteine con sonde fluorescenti (De Rosa L. et al. Org Biomol Chem. 2011)oppure con atomi radioattivi.

In un lavoro recente è riportata la marcatura selettiva dell’ormone leptina con 18F per studiarne la bio distribuzione mediante PET (Flavell RRet al.J Am ChemSoc 2008). Reazioni di EPL sono state anche impiegate nella semisintesi della glicoproteina Ribonucleasi C omogeneamente marcata(Piontek C et al. AngewChemInt Ed Engl 2009).

Inoltre reazioni di EPL sono state impiegate in reazioni di ciclizzazione di proteine(Evans TC et al. J Biol Chem 1999). Altri esempi di applicazioni di inteine sono nella produzione di proteine marcate su singoli domini per studi NMR (segmental labeling).(McGinty RK et al. ACS Chem Biol 2009,Otomo T. et al. Biochemistry 38 ).

L’efficienza dello splicing proteico delle inteine ha permesso loro di trovare un importante ruolo nel campo delle biotecnologie. La purificazione di proteine ricombinanti ha maggiormente beneficiato delle applicazioni di splicing delle inteine. Le tradizionali tecniche di purificazione di proteine incorporano un tag unico (ad esempio, il tag di istidine) in un gene da esprimere.

Questi tag vengono utilizzati per associare la proteina desiderata ad una colonna per cromatografia di affinità e quindi rilasciare la proteina desiderata con l'aggiunta di agenti esterni (ioni, proteasi). Questi metodi sono spesso scomodi perché è necessario purificare ulteriormente la proteina ricombinante da contaminanti, abbassando il rendimento e compromettendola sua stabilità, solubilità, e attività.

Mutando sial’N- o il C- terminale del gene di una inteina, un gene desiderato può essere legato ed espresso insieme al tag costituito dall’inteina. Dopo l'espressione della proteina di fusione questa viene estratta dalla cellula e purificata utilizzando le proprietà dell’inteina. La proteina ricombinante viene rilasciata dal mutante dell’inteina attraverso un cambiamento nelle condizioni di splicing (Chong S. et al. 1997).

Tuttavia, il rilascio della proteinar icombinante dal complesso con l’inteina può essere lento, e puòesseremodificato chimicamente tramite agenti riducenti. Questa metodica è stata commercializzata dalla New England Biolabs (IMPACT TM, Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) dove è possibile fondere un tag costituito da inteina e il dominio di legame della chitina (CBD) alla proteina bersaglio.

In presenza di tioli, l’inteina procede con il self-cleavage liberando la proteina bersaglio dal tag. Il vettore commercializzato può essere utilizzato anche per esprimere e purificare una proteina con un C-terminaletioestereper reazioni di IPL. Miglioramenti sono stati apportati dall’ingegneria proteica per produrre miniinteine con ridotta attività incorporate in un protocollo di purificazione per affinità di proteine ricombinanti.