Risposte immunitarie nei vertebrati ectotermi: attività cellulari e molecolari di leucociti del Teleosteo Dicentrarchus labrax

Lo studio dell’espressione di geni T specifici, dopo stimolazione mitogena, è stata condotta su 3 pool di campioni ciascuno costituito da cellule provenienti da tre diversi individui (spigole da 100-150gr) e i saggi sono stati condotti in triplicato.

I risultati sono stati espressi come la media ± DS dei valori ottenuti. Approssimativamente 10 ng di cDNA (in triplicato) sono stati usati in ogni reazione di PCR e per ogni coppia di primers è stato fatto il controllo negativo (in duplicato), aggiungendo acqua al posto del templato.

I primer utilizzati sono elencati in tabella 4. Le cellule ottenute dalle branchie sono state arricchite in leucociti mediante percoll e poi sono state seminate in fiaschette (Greiner Bio – One) da 75 cm3, in ciascuna delle quali sono state seminate nella quantità di 1 x 105 cellule/ml e incubate a 18 °C per 24 e 48 ore con due differenti lectine mitogene: 5 µg/ml di PHA-L (Sigma) e con 5 µg/ml di ConA (Sigma).

I campioni di controllo non sono stati stimolati ma soltanto incubati per gli stessi tempi con PBS. Si è proceduto quindi con l'estrazione dell'RNA totale (paragrafo 2.7.6) che è stato usato per fare una RT-PCR con i primers specifici per il gene della β-actina per verificarne l’integrità e poi è stata determinata la concentrazione dell’RNA totale e preparato il cDNA. Sono stati disegnati primers specifici sia per i geni di interesse che per l’rRNA 18S scegliendoli in modo da avere prodotti di amplificazione piccoli (circa 200 bp) (Vedi tabella).

A questo punto è stata condotta una Q-PCR per indagare l’espressione dei geni d’interesse impiegando come normalizzatore l’rRNA 18S. Approssimativamente 10 ng di cDNA (in triplicato) sono stati usati in ogni reazione di PCR e per ogni coppia di primers è stato fatto il controllo negativo (in duplicato), aggiungendo acqua al posto del templato.

Il programma utilizzato è:
- denaturazione iniziale per 10 minuti a 95° C
- denaturazione per 45 secondi a 95° C
- annealing per 45 secondi a 52° C - estensione per 45 secondi a 72° C
- analisi della curva di melting a 52° C (metodo “all points”): quest’ultimo passaggio è utile per verificare la specificità del picco d’amplificazione, che è comunque esaminato con l’elettroforesi su gel d’agarosio.

I valori di fluorescenza sono raccolti durante la fase di estensione dell’amplificazione e per l’analisi dei dati è utilizzato il metodo “endpoints” del software Mx3000PTM.