L'impiego del metodo del Reverse Dot Blot per la diagnosi molecolare della Fibrosi Cistica

Il Southern Blot, dal nome del suo inventore Edward Southern, è una tecnica che permette di identificare, dopo un’elettroforesi e mediante una sonda, il frammento di DNA d’interesse tra quelli che hanno corso sul gel. Analizziamo nel dettaglio le varie fasi del Southern Blot (vedi figura 16).

Il punto di partenza del Southern Blot è l’estrazione del DNA dalle cellule. Il DNA dell’individuo a cui è eseguita l’analisi è sottoposto alla digestione da parte degli enzimi di restrizione, endonucleasi capaci di tagliare il DNA a doppio filamento in siti specifici, detti siti di restrizione. Si otterranno dei frammenti di lunghezza diversa, in relazione alla localizzazione dei siti di restrizione. In seguito si fa l’elettroforesi dei frammenti ottenuti in gel di agarosio.

Si procede a questo punto con la denaturazione del DNA, necessaria per la successiva ibridazione delle singole catene di DNA con la sonda marcata. La denaturazione in genere viene fatta attraverso l’immersione del gel in una soluzione di NaOH per circa 15 minuti. A questo punto si realizza il “blotting”, ovvero il trasferimento dei frammenti di DNA sulla membrana. Il gel viene adagiato su un supporto adeguato in genere di vetro o di plexiglass, rivestito di carta assorbente.

Le estremità della carta sono immerse in un tampone che viene aspirato per capillarità. Successivamente il gel viene coperto con un foglio di nylon e sopra sono posti una serie di fogli di carta assorbenti, in cima ai quali si pone una lastra di vetro ed un peso di circa 500 g. Per capillarità nell’arco di 12-24 ore la soluzione tampone tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nylon e risalirà nei fogli assorbenti. I frammenti di DNA sono trascinati in verticale dal flusso del tampone e si depositano sulla membrana instaurando legami elettrostatici.

A questo punto la membrana viene separata dal gel e immersa in una soluzione contenente una sonda marcata, descritta in dettaglio nel paragrafo 5.1.2. La sonda può ibridare con i segmenti complementari sul foglio, permettendo in questo modo di identificarli. Dopo il lavaggio della membrana, per rimuovere la sonda non ibridata, si fa una lastra autoradiografica che mette in evidenza le bande in cui la sonda ha legato il DNA genomico.