Subproteomi delle membrane mitocondriali di muscolo cardiaco bovino: nuove metodologie di isolamento

Le proteine di membrana svolgono un importante ruolo in differenti processi cellulari, tra cui la trasduzione del segnale, l’adesione cellulare, il trasporto di ioni e l’endocitosi. Recenti studi di carattere genomico hanno stimato che le proteine di membrana costituiscono circa il 30% del patrimonio proteico totale. Tali proteine svolgono un ruolo centrale nella vita della cellula e destano anche un ragguardevole interesse farmacologico, numerosi infatti sono i farmaci che agiscono modulando l’attività della proteine di membrana. Non stupisce quindi che tali proteine vengano correntemente analizzate mediante l’uso di numerosi metodi biochimici, tra cui l’elettroforesi bidimensionale (2-DE). Tale metodo, veloce e sensibile, permette di separare le proteine e di evidenziare eventuali modifiche post-trasduzionali con la comparsa della tipica distribuzione tipo “spots train”. Sebbene l’elettroforesi 2-D permetta un’elevata risoluzione, spesso il metodo di preparazione del campione può portare ad una ingannevole distribuzione degli spots. Questo risulta ancora più evidente nel caso in cui si vada ad effettuare la separazione di proteine di membrana, le quali è noto essere caratterizzate da un elevato grado di idrofobicità e da una bassissima solubilità nei più comuni buffer.
La sottoespressione su gel 2-DE delle proteine di membrana può essere attribuita a tre fattori:
1. Le proteine di membrana sono generalmente poco abbondanti, tanto da non poter essere rivelate in gel standard. Questo è particolarmente vero per proteine di membrana estratte da cellule eucariotiche complesse.
2. Le proteine di membrana hanno generalmente punti isoelettrici alcalini, cosicché non possono essere visualizzate su gel 2-D, i quali consentono l’analisi di proteine acide o debolmente basiche. Per la IEF possono essere utilizzati gradienti di pH estesi ma bisogna sempre tenere in considerazione l’effetto endosmotico dovuto al gradiente.
3. Il terzo fattore che può determinare la sottoespressione delle proteine di membrana su gel 2-D è la solubilità, infatti, esse risultano poco solubili nei mezzi acquosi usati per la IEF. Questo probabilmente è il problema più rilevante per le proteine di membrana, poiché esse risultano solubili solo nei bilayer lipidici.
L’approccio proteomico e le tecniche correlate richiedono un’ottima solubilizzazione delle proteine d’interesse. Per ovviare al problema della solubilizzazione vengono usati dei detergenti che mimano l’ambiente lipidico all’interno delle micelle, ma questa capacità di mimesi varia da un detergente all’altro. Per poter ottenere una buona separazione delle proteine su gel 2-D l’ambiente lipidico della membrana deve essere dissolto, e i lipidi rimanenti non devono interferire con l’analisi IEF. Le proteine devono essere estratte dalla membrana in forma solubile, generalmente complessate con il detergente, inoltre, esse devono rimanere solubili durante il processo di IEF specialmente quando raggiungono il loro pI, il quale indica il punto minimo di solubilità di ogni proteina. Per poter solubilizzare le proteine integrali di membrana le soluzioni standard a base di urea non sono consigliabili, infatti, esse risultano meno efficienti dei detergenti in soluzione acquosa. Questo probabilmente è dovuto al fatto che la denaturazione delle proteine ad opera di caotropi muta il carattere idrofobico delle proteine, aumentando i siti disponibili all’aggregazione, diminuendo quindi la solubilizzazione. L’analisi 2-DE viene generalmente effettuata usando detergenti a base di urea e detergenti non ionici, rivelandosi spesso fallace, tranne nei casi in cui le proteine non siano glicosilate ed abbiano un solo segmento trans membrana, in questo caso, poiché non molto idrofobiche, l’analisi 2-DE permette l’ottenimento d’interessanti risultati.
Talvolta è necessario ricorrere ad alcuni “trucchi”, come per esempio metodi di rivelazione ultra-sensibili per preparazioni complesse, quali il blotting, oppure adottare i classici metodi di colorazione solo su proteine provenienti da complessi protocolli di purificazione.
La solubilità delle proteine di membrana non è il solo fattore limitante che gioca un ruolo determinante per la loro analisi su gel 2-DE, ma anche la natura dei lipidi è molto importante. I lipidi interferiscono nell’analisi delle proteine di membrana, per cui bisogna allontanarli mediante l’uso di solventi organici. La delipidificazione mediante solventi organici non è facile da effettuare poiché alcune proteine possono ripartirsi nel solvente, mentre altre possono precipitare e non possono essere più solubilizzate, determinando così una perdita di tali proteine. Inoltre è chiaro che la delipidificazione elimina il problema dell’interferenza dei lipidi ma non quello della solubilità.
Una scarsa risoluzione delle proteine di membrana nei gel 2-DE non solo è dovuta alla scarsa solubilità ed all’interferenza dei lipidi, ma anche ad una loro limitata estrazione dalla membrana. All’ interno dei microprecipitati di proteine possono essere inglobate altre proteine che possono ostacolare l’estrazione e l’analisi delle proteine d’interesse. Per ovviare a tali problemi si utilizzano soluzioni d’estrazione non aggressive, mentre i lipidi e le proteine insolubili vengono allontanati mediante centrifugazione, prima della denaturazione finale nel buffer di IEF. [...]