Identificazione di specie ittiche tramite amplificazione del gene per l'rRNA 5S al fine di rilevare frodi tassonomiche

Una volta che il DNA di interesse è stato estratto e amplificato tramite PCR i prodotti ottenuti devono essere opportunamente analizzati in modo da verificare la presenza o l’assenza del marcatore genetico specie-specifico. Esistono numerosi metodi che possono essere sfruttati per questo scopo e la scelta di uno di questi è un passaggio cruciale per la corretta identificazione delle specie ittiche in esame, poiché è necessario tener conto di numerosi fattori, quali la qualità del materiale genetico di partenza o il tipo e il numero delle specie da differenziare. Inoltre, il metodo scelto deve essere poco costoso, riproducibile e veloce, nel caso in cui debba essere utilizzato per delle analisi di routine all’interno di un laboratorio. Alcuni approcci di esempio sono:

- Forensically informative nucleotide sequencing (FINS): viene ottenuta la sequenza del frammento amplificato per PCR, la quale viene confrontata con le sequenze presenti all’interno di un database, effettuando un’analisi filogenetica. La sequenza che presenta la minor distanza genetica o il minor numero di sostituzioni nucleotidiche rispetto a quella in analisi permette di capire a quale specie appartenga il campione in esame. Questo tipo di approccio, nonostante sia il più diretto e affidabile, è molto lungo e costoso da effettuare, per cui non si adatta ad analisi di routine in laboratorio.

- Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP): una volta ottenuta la sequenza di un frammento di DNA di interesse, è possibile scegliere un enzima di restrizione con il quale digerire l’amplificato ottenuto con la PCR in modo da ottenere un profilo di restrizione specifico per ciascuna specie di interesse. Questo metodo è poco costoso, rapido, riproducibile e molto adatto alle analisi di routine effettuate in laboratorio, però presenta anche un aspetto negativo, dovuto al fatto che non c’è nessuna garanzia che individui della stessa specie diano lo stesso pattern di restrizione, per cui è necessario analizzare un numero elevato di campioni prima di poter validare il sistema.

- PCR-specific primers: viene effettuata una PCR con opportune condizioni di stringenza e utilizzando dei primer specifici per ciascuna specie analizzata, così da ottenere un amplificato solamente nel caso in cui il DNA sotto esame sia quello della specie su cui sono stati disegnati i primer; tutto questo è possibile solo se si è a conoscenza della sequenza target, come nel caso del gene codificante per l’rRNA 5S. Una volta ottenuta la sequenza, questo tipo di approccio è veloce, poco costoso, affidabile e adatto per le analisi di routine effettuate in laboratorio.
E’ chiaro, quindi, che esistono diversi approcci che possono portare alla creazione di strumenti e protocolli di analisi al fine di smascherare “frodi per contraffazione”, anche se, al momento, ognuno di essi richiede di essere studiato in modo più approfondito per una messa a punto e per una successiva validazione.