Organoidi umani: l'anello mancante ai sistemi modello. Focus sugli organoidi intestinali come esempi di applicazioni biomediche

Il primo studio che riporta la costituzione di un organoide 3D, e che è stato la pietra miliare per la successiva formazione di organoidi da diversi tessuti, è quello di Sato et al, nel 2009, che è partito da una cellula staminale adulta intestinale per generare il cosiddetto “mini-gut”.
Fin dagli esordi di questa tecnologia si è intuito quanto utile potesse essere un modello rappresentativo della fisiologia dell’intestino per capirne meglio le funzioni cellulari e la risposta a stimoli, sia fisiologici che patologici. La necessità di trovare un modello più accurato per quest’organo è stata spinta anche da varie limitazioni delle normali colture 2D di queste cellule. In particolare, l’impossibilità di coltivare per più di due settimane cellule epiteliali intestinali primarie, quindi non trasformate né immortalizzate, poiché in seguito all’isolamento andrebbero incontro a morte apoptotica (Wallach e Bayrer, 2017). Questo tipo di coltura basata su una sola linea cellulare, inoltre, non rappresenterebbe fedelmente la complessità del tessuto. Questo è dovuto al fatto che l’epitelio intestinale non è costituito da un unico tipo cellulare, ma da varie linee cellulari ognuna con differenti funzioni (Zhao et al. 2020).
La strada per la formazione degli organoidi intestinali è stata aperta dalla caratterizzazione dei fattori di crescita presenti nella cripta intestinale, necessari per poter mantenere in vitro le cellule staminali, e dall’identificazione del marker delle cellule staminali intestinali Lgr5 (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) (Zachos et al., 2016). I primi tentativi hanno utilizzato la mucosa intestinale neonatale (con epitelio e mesenchima), poi si è passati al primo organoide derivante da cellule staminali adulte murine, non dipendente dal mesenchima per la sua propagazione. Per questa nuova struttura si sono infatti utilizzati una matrice tridimensionale sostituente lo stroma (Matrigel) ed un preciso insieme di fattori, tra cui R-spondina1, Noggin, ed EGF, per ricreare i pathways di proliferazione e rinnovamento cellulari presenti nella nicchia intestinale (Wallach e Bayrer, 2017). Successivamente si è estesa la procedura anche per le cellule staminali adulte umane, ottimizzando per queste il mix di fattori aggiunti alla coltura. Ad esempio, è necessario qui aggiungere Wnt3A esogeno per mantenere le cellule in coltura, poiché gli organoidi umani ne secernono una quantità inferiore rispetto a quelli murini (Kim et al., 2020).
In questo modo si è giunti alla coltura di un monostrato di cellule epiteliali polarizzate, che assume una struttura tridimensionale attorno ad un lume, riproducendo in vitro l’architettura dell’epitelio intestinale. Al contrario degli altri modelli, questa coltura 3D è geneticamente stabile ed è in grado di crescere indefinitamente, mantenendosi nel tempo. In più, è in grado di rappresentare l’eterogeneità cellulare del tessuto e riprodurre le sue principali funzioni quali quelle di assorbimento e di barriera, permettendo così uno studio più fedele della fisiologia dell’organo (Blutt et al., 2019).

L’intestino tenue è costituito da protrusioni chiamate villi, alla base dei quali sono presenti le cripte. Queste contengono le cellule staminali intestinali (ISCs) che servono per l’omeostasi tissutale, permettendo quindi il mantenimento e rinnovamento completo del tessuto ogni circa 5 giorni, e la sua riparazione in seguito a danni chimici (trattamenti farmacologici), fisici (trattamenti con radiazioni), infettivi (microrganismi patogeni) (Blutt et al., 2019). Le ISC sono multipotenti e danno origine a tutte le cellule presenti nell’epitelio intestinale, tra cui le cellule caliciformi mucipare, le cellule di Paneth, le enteroendocrine, le cellule di Tuft, gli enterociti e le cellule M (Zhao et al., 2020). Di conseguenza, per formare organoidi intestinali si può partire da queste cellule staminali adulte prelevate dalla base della cripta tramite biopsia tissutale, oppure si può partire da cellule staminali pluripotenti, sia embrionali che indotte (Blutt et al., 2019). (Figura 4)
Nel primo caso, in base alla regione da cui sono prelevate le cellule staminali adulte (che possono trovarsi non solo alla base della cripta, ma anche isolate nel tessuto), si hanno organoidi con caratteristiche differenti. Se il tessuto d’origine è l’intestino tenue, allora si avranno organoidi che riprodurranno la sua funzione, chiamati “enteroidi”. Se invece le cellule staminali sono prelevate dal colon si avranno i cosiddetti “colonoidi” (Wallach e Bayrer, 2017). Siccome le ISC estratte, fatte crescere con fattori di crescita esogeni all’interno di una matrice tridimensionale, hanno la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari intestinali, la loro coltura riprodurrà la diversità cellulare dell’epitelio intestinale presente in vivo, e i differenti tipi cellulari si troveranno nelle stesse proporzioni presenti in vivo. La formazione dell’enteroide passa inizialmente da una fase in cui è definito sferoide. In questa struttura le cellule sono polarizzate, e la loro porzione apicale si trova affacciata all’interno del lume, mentre la porzione basolaterale è esterna, a contatto con il medium. Dopo 5 giorni, i fattori di crescita vengono diminuiti, per permettere il differenziamento delle cellule staminali, che così vanno a formare la tipica struttura costituita da villi e cripte (Zachos et al., 2016). Il differenziamento è possibile perché queste cellule non secernono una grande quantità di fattori di crescita, i quali andrebbero a mantenere la staminalità. Questo porta le cellule immature alla base della cripta a trasformarsi in cellule che assorbono nutrienti e secernono enzimi digestivi, mimando le funzioni delle cellule adulte presenti in vivo (Zachos et al., 2016).
Gli organoidi derivanti dalle iPSC si differenziano dai precedenti poiché hanno un fenotipo meno maturo e più simile al tessuto intestinale fetale (Blutt et al., 2019). Questo deriva dalla presenza non solo di cellule epiteliali come i precedenti, ma anche di cellule mesenchimali attorno allo strato epiteliale. Infatti queste ultime producono costantemente fattori di crescita, che impediscono il completo differenziamento, sostenendo invece la proliferazione cellulare (Zachos et al., 2016). L’organizzazione in villi e cripte, tuttavia, si può raggiungere anche partendo da PSC se gli organoidi che ne derivano vengono trasferiti all’interno di un topo immunocompromesso, in una zona altamente vascolarizzata. In questo modo si possono studiare anche le interazioni tra l’epitelio intestinale e il mesenchima, e come queste cellule trapiantate possano aiutare a riparare un intestino danneggiato (Blutt et al., 2019).

Gli organoidi intestinali, essendo riproduzioni in miniatura dell’intestino umano, sono modelli più accurati rispetto le colture in due dimensioni di linee cellulari trasformate e rispetto i modelli animali, i quali non possono simulare fedelmente, ad esempio, l’interazione tra cellule intestinali e microbiota o sistema immunitario, a causa delle differenze interspecie. Tuttavia, non sono esenti da limiti, che dovranno essere superati per poter migliorare questa tecnologia nell’immediato futuro. Un primo possibile avanzamento sarebbe quello di creare una co-coltura: questo permetterebbe di avere non solo le cellule epiteliali, ma anche cellule mesenchimali e del sistema immunitario, per poter modellizzare anche queste interazioni, essenziali per la funzionalità dell’organo in vivo (Zhao et al., 2020). Ad esempio, si potrebbero integrare negli organoidi i progenitori mesodermici derivanti da iPS, per formare vasi sanguigni che crescano insieme all’organoide stesso, come è stato sperimentato da Worstorfer et al. nel 2019, con organoidi cerebrali e tumoroidi. Inoltre, visto che il sistema immunitario gioca un ruolo molto importante in questo tessuto a contatto con miliardi di microrganismi, è possibile implementare nell’organoide anche i linfociti intraepiteliali, che possono espandersi inserendo in coltura specifiche interleuchine (Nozaki et al., 2016).
Per evidenziare alcune delle loro potenzialità che li portano ad essere sfruttati in vari ambiti, di seguito saranno riportati esempi recenti di vari utilizzi di questo tipo di organoidi: dalla modellizzazione delle interazioni tra cellule e microrganismi a quella delle malattie multifattoriali, campi che intersecano anche la medicina personalizzata e l’editing genomico.