Sviluppo e applicazione di metodiche per il dosaggio plasmatico degli antibiotici linezolid e vancomicina mediante HPLC

Nello sviluppo di una metodica per il dosaggio plasmatico di un farmaco vengono solitamente messi a punto contemporamente sia il metodo di estrazione da plasma sia la metodica analitica, nel nostro caso l’analisi cromatografica mediante HPLC. Di seguito descriverò inizialmente la messa a punto del metodo di estrazione e successivamente la messa a punto dell’analisi cromatografica. Le figure che verranno mostrate faranno riferimento sia ad estratti plasmatici contenenti il farmaco (linezolid, abbreviato LZD) sia ad estratti di plasma blank, ossia plasma a cui non è stato aggiunto il farmaco. Precedentemente al mio lavoro di tesi, nel nostro laboratorio era stato messo a punto un metodo di dosaggio plasmatico del LZD che impiegava una metodica di estrazione “in fase solida” (solid phase extraction, SPE) ovvero con l’impiego di colonnine che contengono una matrice solida. Tuttavia questa metodica era piuttosto lunga, con conseguente dispendio di tempo, e richiedeva l’utilizzo di diversi solventi e materiali, e apparecchiature particolari. Si è provato allora a saggiare un metodo di estrazione di tipo liquido-liquido (ossia metodi di estrazione che non fanno uso di una matrice solida, ma con i quali da un liquido biologico la sostanza di interesse è estratta, o meglio, separata, attraverso l’impiego di un solvente organico come acetonitrile, esano, isopropanolo, sfruttando la diversa costante di ripartizione della sostanza tra le due fasi, o attraverso l’impiego di un acido forte in grado di provocare una variazione nell’ambiente in cui si trova la sostanza da separare, come ad esempio l’acido perclorico che provoca denaturazione delle proteine plasmatiche), in quanto questi metodi di estrazione sono riportati in letteratura anche per il LZD (es. Borner et al., 2001) ed inoltre sono già stati impiegati nel nostro laboratorio per altri composti con risultati molto soddisfacenti. Secondo la metodica impiegata da Borner, a 300 μl di campione plasmatico sono aggiunti 300 μl di acido perclorico (PCA) al 7% (precedentemente preparato diluendo il PCA al 70%), si mescola con vortex per 5 minuti e il tutto viene centrifugato a 15000xg per 5 minuti; 300 μl del surnatante sono quindi trasferiti in una vial, diluiti con 600 μl di tampone acetato a pH 3,5 e vengono iniettati in colonna 50 μl. Al fine di saggiare la metodica di estrazione liquido-liquido per il LZD abbiamo inizialmente provato ad applicare la metodica messa a punto nel nostro laboratorio per il ganciclovir (abbreviato GCV), molto simile a quella riportata da Borner: a 150 μl di campione plasmatico vengono aggiunti 7,5 μl di acido perclorico (PCA) al 70% e si mescola bene con vortex la miscela ottenendo precipitazione delle proteine plasmatiche. Successivamente si centrifuga una prima volta, per 10 minuti a 13000 rpm, si preleva il surnatante privo delle proteine, e questo è nuovamente centrifugato per 5 minuti a 13000∙rpm per eliminare ogni eventuale residuo di materiale corpuscolato. Il surnatante viene poi iniettato direttamente in colonna (20 μl) e analizzato mediante HPLC. In figura 5.1 è riportata l’analisi del campione con la metodica cromatografica per il LZD da noi messa a punto (vedi paragrafo 5.1.b).