Effetto della Cannabidivarina, componente non psicoattiva della marijuana, sulla proliferazione, migrazione e invasione di una linea di glioma U87

La linea cellulare è stata mantenuta in coltura in un incubatore (Forma scientific-modello 3194) ad una temperatura di 37°C, con un’atmosfera avente una percentuale di anidride carbonica (CO2) pari al 5% e un’umidificazione elevata (95% di umidità). Le cellule sono state seminate all’interno di fiasche T75 (BD Falcon, Sacco, Como) con medium DMEM (Sigma) arricchito con 10% di siero fetale bovino (FBS) (Sigma) inattivato al calore, 2% di L-glutammina (Sigma), 1% di penicillina/streptomicina (Sigma), 1% di sodio piruvato (Sigma), 1% di amminoacidi non essenziali (Sigma). Per i trattamenti è stato invece utilizzato un terreno minimo in cui sono state disciolte le molecole. Tale medium è caratterizzato da una percentuale di siero pari a 0.1% e ha un’aggiunta di ITS-liquid media supplement all’1% (5 μg/ml d’insulina, 5 μg/ml di transferrina e 5 ng/ml di selenite di sodio) (Sigma).
Per il rinnovo della coltura, dopo aver rimosso il medium, il monostrato cellulare è stato lavato con PBS per eliminare completamente il siero e i cationi presenti nel terreno. In seguito, è stato aggiunto al monostrato cellulare 1 ml di tripsina-EDTA (Sigma, soluzione allo 0.5% di tripsina e 0.2% di EDTA) al fine di permettere il distacco delle cellule dal supporto di crescita senza danneggiarle. L’enzima è stato lasciato agire per 1 minuto, ponendo la fiasca in incubatore, e in seguito neutralizzato dall’aggiunta di un’aliquota di medium completo: il calcio contenuto nel siero è in grado di bloccare l’azione della tripsina. Tale aliquota è stata pipettata più volte scaricando la sospensione in punti diversi della fiasca, al fine di risospendere le cellule fino all’ottenimento di una sospensione monocellulare. Dalla fiasca è stata prelevata un’aliquota della sospensione cellulare necessaria per la conta cellulare in camera di Burker, opportunamente diluita in Trypan blue. Il Trypan blue è un colorante in grado di colorare selettivamente le cellule morte. Le cellule vitali, avendo la membrana intatta, non permettono la penetrazione di questo colorante nel citoplasma; al contrario, nelle cellule morte questo penetra facilmente, rendendole distinguibili dalle vive con una rapida analisi al microscopio. In seguito, in base ai risultati della conta cellulare, è stato prelevato dalla fiasca madre un volume adeguato di cellule da seminare in fiasche nuove in presenza di terreno completo (densità di semina ottimale 0.8 x 106 cellule/fiasca).