Sovraespressione di Sonic Hedgehog in topi transgenici: influenza della proteina sull'apoptosi e sulla proliferazione cellulare durante lo sviluppo degli arti

Per ottenere una specifica espressione di SHH nei condrociti, il cDNA completo di SHH è stato posto sotto il controllo trascrizionale della regione regolatrice del protocollageno murino α1 (II) gene Col2a1 (Tavella et all, 2004). Questa regione è stata utilizzata con successo per una espressione mirata di diversi cDNA nei condrociti (Garofalo et al., 1999; Zhou et al., 1995).
I topi transgenici sono stati identificati tramite l'utilizzo delle tecniche di PCR e Southern Blot. L'espressione del transgene è stata identificata mediante l'utilizzo della tecnica del RT-PCR ed immunoistochimica (Tavella et al., 2004).
Il topo Col2-SHH mostrava un fenotipo letale alla nascita, si riscontrava una forma severa di craniorachischisi, una condizione nella quale il condrocranio rimaneva aperto. Sono stati generati 26 embrioni transgenici e 22 di questi (84%) mostravano craniorachischisi. Purtroppo nessun animale è sopravissuto e quindi non è stato possibile stabilire una linea.
A livello del cranio, le ossa esoccipitali e sovraoccipitali erano assenti, mentre le altre ossa membranose risultavano normali. La capsula otica e gli ossicini erano iperplastici, mentre la mandibola risultava essere ipoplastica.
Lo scheletro assiale mostrava grosse alterazioni. Accanto all'assenza degli archi posteriori e dei processi spinosi della vertebre, l'istologia evidenziava un allargamento dei corpi vertebrali con processi laterali molto larghi che erano fusi con il corpo. I gangli erano spostati posteriormente ed i nervi compressi dalla cartilagine, cresciuta in maniera abnorme. Il tubo neurale era completamente chiuso ed avvolto dalle meningi che erano in diretto contatto con lo strato sottile della pelle. Le costole risultavano quasi interamente colorate da Alizarina Red.
mostravano un fenotipo distorto, con una spiccata variabilità ed un incremento nelle dimensioni. In alcuni casi si osservava una fusione tra loro o con le vertebre. Non erano distinguibili le giunzioni costocondrali.
Lo sterno era completamente formato da cartilagine ed apparentemente diviso a metà della linea mediana. Inoltre tutti e quattro i centri di ossificazione non erano presenti.
Nel topo normale, Shh è assente nel growth plate delle ossa lunghe, ma Ihh era presente in un sottoinsieme di condrociti che precedono lo stadio ipertrofico.
Negli animali transgenici, SHH è stato evidenziato utilizzando un anticorpo specifico per la regione amminoterminale e si riscontrava associato essenzialmente ai condrociti, piuttosto che a livello della matrice extracellulare. Questo dato era coerente con i dati riportati in letteratura, in cui si riscontrava che il frammento amminoterminale di Shh si ritrovava prevalentemente ancorato alla membrana cellulare (Peters et al., 2004).
Il nostro lavoro si è focalizzato sullo sviluppo degli arti e, in particolare, sulla formazione delle articolazioni negli animali transgenici.
La colorazione con Alizarina e Alcian Blu in embrioni di 18,5 dpc, rivelava profondi cambiamenti negli elementi scheletrici. Oltre alla persistente presenza della cartilagine nelle diafisi delle ossa lunghe negli animali transgenici (Tavella et al., 2004), si riscontrava un evidente difetto nelle articolazioni, in particolare quelle che derivavano dalla divisione del mesenchima.
A livello delle articolazioni del gomito e del ginocchio, si osservava un'alterazione nella formazione delle epifisi delle ossa lunghe, che risultavano drammaticamente deformate. All'osservazione, il processo olocranico dell'ulna, presentava una espansione posteriore, la parte distale dell'epifisi dell'omero non si articolava con il radio e l'ulna come si osservava nel topo normale. Nell'animale transgenico, il ginocchio e la parte distale del femore mancavano della normale divisione rispetto alla parte prossimale della tibia, includendo la rotula in un unico segmento cartilagineo. [...]