Valutazione di zebrafish come modello per analisi patogenetiche nella sindrome di Alagille.

La sindrome di Alagille (ALGS; OMIM #118450) è una patologia genetica autosomica dominante che colpisce fegato, cuore, occhi, cartilagini facciali e vertebre (Oda 1997). Le anomalie vascolari ed epatiche sono la principale causa di mortalità (15-20% dei casi) e morbidità della sindrome. Le anomalie congenite cardiache sono responsabili dalla maggioranza della mortalità neonatale, mentre i difetti epatici della mortalità in età più avanzata (Krantz 1999). La sindrome è caratterizzata da: scarsezza dei dotti biliari associata ad almeno tre delle cinque manifestazioni seguenti: colestasi, difetti cardiaci (tetralogia di Fallot, associata in alcuni casi a stenosi polmonare), manifestazioni oculari (“embriotoxon posteriore”, un’anomalia congenita della cornea), anomalie scheletriche (vertebre a farfalla), fenotipo facciale ( “facies triangolare”, con fronte ampia e prominente, mento appuntito ed occhi infossati) (Oda 1997).

Analisi citogenetiche di pazienti sindromici hanno permesso di mappare il gene responsabile della patologia in posizione 20p12. In tale regione è stata individuata la sequenza codificante del gene JAGGED 1 (JAG1), un ligando del recettore Notch. Il gene si estende per 36 kb, contiene 26 esoni, e codifica per un RNA messaggero di 5.9 kb. La proteina si compone di 1218 aa (Oda 1997; Li, 1997 e database GenBank).
L’ALGS manifesta penetranza incompleta, con variabilità fenotipica estremamente elevata anche tra familiari. Le manifestazioni sono variabili e può presentarsi un quadro subclinico oppure tale da mettere a rischio la sopravvivenza. Una prima possibile spiegazione a questa espressività variabile è l’esistenza di modificatori genetici ed ambientali (Kamath 2003; Krantz 1997). Nel 94% dei casi di Alagille si riscontrano mutazioni nel gene JAG1 (ALGS1, OMIM: #118450) (Warthen, 2006), mentre nell’ 1% degli affetti si trovano mutazioni in NOTCH2 (ALGS2, OMIM: #610205) (McDaniel, 2006); per i restanti pazienti la causa patogenetica rimane tuttora oscura. Pazienti aventi delezioni più o meno estese del gene JAGGED1 hanno fenotipo indistinguibile da pazienti aventi mutazioni missenso o nonsenso; ciò porta ad ipotizzare che il meccanismo patogenetico dell’Alagille sia dovuto all’aploinsufficienza di JAGGED1 (Krantz 1998).

Recentemente, è stato dimostrato sia in vivo in Drosophila sia in vitro (NIH3T3) che particolari mutazioni, sia missenso che nonsenso, sono in grado di evadere il meccanismo di degradazione cellulare degli mRNA-nonsenso/messaggeri mutati. La risultate proteina anomala verrà quindi esposta in membrana.

Fibroblasti isolati da un feto Alagille dimostravano un fenotipo a corda se paragonati a fibroblasti di feti normali. Per verificare se la responsabile di quel particolare fenotipo fosse la proteina tronca codificata dal gene mutato, sono state trasfettate delle cellule di fibroblasto con un vettore inerte, un vettore per JAGGED1_wt ed alcuni vettori per proteine mutate. Tutte le cellule di fibroblasto trasfettate, ad esclusione di quelle trasfettate con JAGGED1 selvatico o il vettore inerte, dimostravano fenotipo a corda molto simile a quello osservato nei fibroblasti di feto Alagille. Inoltre, cellule di fibroblasto selvatico cresciute in un medium condizionato da proteine mutate o selvatiche dimostrano anch’esse un fenotipo “a corda”. Sulla base di queste osservazioni, si suppone che alcune forme solubili siano in grado di legare il recettore Notch e competere quindi con la forma selvatica trans-membrana dei ligandi senza tuttavia essere in grado di scatenare la cascata di segnale; per questo motivo, non è possibile escludere l’esistenza di effetti a dominanza negativa.