Studio di vescicole extracellulari rilasciate da cellule di glioblastoma per scopo diagnostico

Come primo step verso la comprensione dei tipi di vescicole extracellulari rilasciate dalle cellule di glioblastoma (GBM) in coltura, e se e come esse differiscono in relazione alla linea cellulare di GBM considerata, è stato usato il tradizionale metodo dell'ultracentrifugazione, considerato al momento il metodo gold standard pcr la purificazione delle vescicole extracellulari (Thery et al., 2006), per isolare e caratterizzare le microvescicole e gli esosomi rilasciati nel mezzo di coltura.

Sono stati usati 3 protocolli di ultracentrifugazione, differenti per tempi e velocità di centrifugazione, e le vescicole isolate sono state osservate al microscopio elettronico a trasmissione (Figura I). Il protocollo di isolamento è stato messo a punto utilizzando le cellule U87MG, in quanto tale linea cellulare è la più utilizzata in letteratura per studi sulle vescicole rilasciata da cellule di GBM. Tra i protocolli utilizzati, il primo, che prevede tempi e velocità di centrifugazione minori (Figura I A), permette di isolare un numero inferiore di vescicole, sia microvescicole che esosomi, che risultano impacchettati tra di loro.

Inoltre, la frazione contenente gli esoso mi si presenta non pura relativamente al diametro delle vescicole, in quanto sono ancora presenti microvescicole. Aumentando la velocità di centrifugazione, invece, aumenta la quantità di vescicole isolate, che risultano, comunque, ancora impacchettate e non disperse in modo omogeneo (Figura IB). La metodica migliore per ottenere delle vescicole in modo ottimale, sia per quanto riguarda la quantità di vescicole che la loro dispersione è quella riportata nella Figura 1 C. In tutti gli esperimenti riportati di seguito la metodica di isolamento fa riferimento al protocollo riportato in 1 C.