Caratterizzazione scheletrica di un modello animale di mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI)

Le gravi anomalie a carico del tessuto osseo e cartilagineo di pazienti e modelli animali MPS VI, evidenziate da questo e da altri studi, insieme alla limitata efficacia sul fenotipo scheletrico delle terapie attualmente utilizzate per il trattamento della patologia, rendono necessario lo sviluppo di strategie terapeutiche in grado di migliorare l’efficacia dei protocolli di trattamento sul fenotipo in questione.

Uno di questi è l’aggiunta di sequenze ripetute di acidi aspartici (asp) ad una proteina, in questo caso l’ArsB, per aumentarne l’affinità per il tessuto osseo. Abbiamo quindi aggiunto, tramite PCR, la sequenza codificante (CDS) per una coda di 6 asp al C-terminale della CDS dell’ArsB di ratto (rArsB).

La sequenza così ottenuta (ArsB-6ASP), è stata clonata all’interno di un vettore di espressione sotto il controllo del promotore ubiquitario CMV (promotore + “enhancer” del cytomegalovirus). Al fine di caratterizzare la proteina, così ingegnerizzata, abbiamo trasfettato cellule renali di scimmia (COS-7) con tre differenti plasmidi: uno esprimente la CDS dell’ArsB di ratto (pArsB), uno quella dell’ArsB-6-Asp (pArsB-6-Asp) ed un terzo plasmide di controllo codificante per la proteina fluorescente verde (peGFP).

In tutti i casi, insieme al vettore selezionato, è stato cotrasfettato un plasmide codificante per l’enzima modificante le solfatasi SUMF1. Questo perché le cellule trasfettate, esprimendo livelli di ArsB molto più alti di quelli endogeni, potrebbero non riuscire a modificare tutta la proteina prodotta in forma attiva per mancanza di sufficienti livelli di SUMF1.

In questo modo, quindi, si evita che il sistema di modificazione delle solfatasi vada a saturazione ed è possibile osservare con precisione differenze nei livelli di ArsB prodotti dalle cellule trasfettate con i diversi costrutti. Inoltre, per normalizzare l’efficienza della trasfezione in ciascun campione, tutte le cellule sono state co-trasfettate con un plasmide codificante per la eGFP sotto il controllo del promotore ubiquitario CBA, promotore ibrido tra l’ ”enhancer” del promotore CMV ed il promotore della β-actina di pollo.