Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

L’RNA viene estratto dalla corteccia cerebrale di ratti trattati per Cortical Spreading Depression, e sacrificati dopo 24 ore dall’induzione della stessa. Il protocollo utilizzato per l’estrazione è basato sul reagente TRIzol, una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato. Pestello, mortaio, bisturi e pinzette vengono sterilizzati mediante immersione in una soluzione di NaOH 0.1 M per 10 minuti e successivamente sottoposti ad un primo lavaggio in acqua distillata ed un secondo lavaggio in acqua DEPC. Pestello e mortaio sono preraffreddati ponendoli in un basket pieno di ghiaccio secco, e il tessuto da processare viene pesato su di una bilancia analitica agendo velocemente per evitare che si scongeli. Subito dopo viene trasferito nel mortaio dove viene versato dell’azoto liquido e subito polverizzato con l’aiuto del pestello. Il tessuto polverizzato viene trasferito in un tubo sterile da 2 mL dove viene aggiunto TRIzol in ragione di 1mL ogni 100mg, il tutto viene trasferito in un potter dounce dove il tessuto viene disgregato del tutto. Questa operazione richiede circa 1-2 minuti e viene condotta mantenendo il potter in ghiaccio per evitare l’eccessivo riscaldamento della soluzione.

Dopo l’omogenizzazione, il materiale insolubile viene rimosso dall’omogenato mediante centrifugazione a 12000 g per 10 minuti a 4°C in centrifuga Eppendorf 5415D. A questo punto viene recuperato il surnatante contenente l’RNA e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente per favorire la dissociazione dei complessi nucleoproteici. Vengono poi aggiunti 200 µL di cloroformio per ogni mL di TRIzol iniziale e si mescola vigorosamente per circa 15 secondi, la soluzione viene lasciata per tre minuti a temperatura ambiente e poi si centrifuga a 12000g per 15 minuti a 4°C. La centrifugazione separa la fase inferiore di fenolo-cloroformio dalla fase superiore acquosa contenente l’RNA che viene recuperata e posta in un altro tubo sterile da 1,5 mL. L’RNA viene riprecipitato dalla fase acquosa superiore aggiungendo circa 500 µL di isopropanolo per ogni mL iniziale di reagente TRIzol e si lascia in incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo di ciò si centrifuga a 12000 g per 10 minuti a 4 °C, si rimuove il supernatante e si lava una volta il pellet con 500 µL di etanolo diluito al 75% con acqua DEPC (dietilpirocarbonato che inibisce le RNasi ). Si centrifuga a 12000 g per 5 minuti a 4 °C, si elimina l’etanolo e si lascia asciugare il pellet per almeno 10 minuti in cappa sterile a flusso laminare in ghiaccio. Infine l’RNA viene risospeso in circa 20 μL di acqua trattata con DEPC, e posto per 10 minuti a 60 °C per aiutare la solubilizzazione del pellet. La concentrazione dell’RNA estratto viene determinata con uno spettrofotometro (NanoDrop 1000 Thermo Scientific). L’esattezza di tale concentrazione e l’integrità dell’RNA è verificata mediante elettroforesi dell’RNA su gel di agarosio in condizioni denaturanti ed il grado di purezza della preparazione è stato determinato calcolando il rapporto tra assorbanza a 260 nm e quella a 280 nm che per un RNA puro è compreso tra 1,5 ed 1,8.