Peptidi overlapping derivanti da sequenze gH-omologhe di HSV-1 come inibitori dell'attività virale.

Dopo aver ottenuto la libreria peptidica ne abbiamo testato la capacità di intercalarsi ai peptidi sintetici, inibendo HSV-1. La valutazione è ottenuta valutando la capacità del virus di formare placche di lisi su monostrati cellulari di VERO. Abbiamo condotto gli esperimenti sui controlli in parallelo rispetto a quello con i peptidi da testare.

Vi sono vari modi di testare l’attività inibitoria dei peptidi sulle glicoproteine virali: il “pre-treatment”, che prevede l’inserimento del peptide sulle cellule in coltura prima dell’infezione virale, il “co-treatment” col quale peptidi e particelle virali vengono inoculati in contemporanea sulle cellule ed il “post-treatment” che prevede invece l’inoculo virale prima dell’aggiunta dei peptidi.

Il test che abbiamo eseguito è quello di “co-treatment”. L’esperimento parte da una coltura cellulare di VERO, su cui vengono incubati i peptidi, a concentrazioni crescenti, in presenza di virus per 45 min a 37°C.Le concentrazioni di peptide utilizzate possono variare tra 1 e 200 µM. La concentrazione ritenuta ottimale per un efficace inibizione e per un buon dosaggio farmacologico è quella di 150 µM.

Le particelle virali non infettanti sono state eliminate con un tampone acido (pH 3.0). In seguito le cellule sono state incubate per 36-40 h a 37°C in terreno DMEM arricchito con CarbossiMetilCellulosa (CMC). Il monostrato cellulare è stato fissato e colorato con X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactopyranoside), per evidenziare le placche virali e procedere alla loro conta.

Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato per ciascun peptide, e la percentuale di inibizione è stata calcolata rispetto al controllo, contenente virus in assenza di peptide. Il calcolo eseguito valuta la percentuale di attività virale, da cui si può poi risalire all’efficienza di inibizione peptidica in termini percentuali.