Discriminazione chimica e molecolare di due specie endemiche della Sardegna: Salvia desoleana Atzei et Picci e Salvia sclarea L.

I risultati ottenuti in questo lavoro s’inquadrano in un progetto di ricerca pre-applicativa che riguarda la determinazione chimica e molecolare di specie appartenenti al genere Salvia mediante l’analisi degli oli essenziali e tramite la messa a punto di una metodica rapida e sensibile PCR-RFLP, basata sulla caratterizzazione delle sequenze NTS del gene 5S-rRNA.

Per quanto concerne la parte biomolecolare, il lavoro ha presentato una fase iniziale di estrazione e amplificazione del DNA. La messa a punto del metodo di amplificazione è stata effettuata considerando i lavori precedentemente svolti riguardanti altre piante aromatiche e la composizione biochimica della matrice vegetale, con particolare attenzione per possibili sostanze inibenti la reazione di amplificazione (Gnavi et al., 2010). I risultati ottenuti attraverso la semplice amplificazione hanno permesso una prima discriminazione per diversa lunghezza di banda. Dagli allineamenti effettuati è emersa una notevole diversità tra le sequenze delle specie prese in esame.

Le specie S. desoleana (SD), S. sclarea (SS) e S. sp (SP) oltre a presentare un’elevata diversità morfologica (cfr. paragrafo 1.5 e tabella 1.5.1), presentano diversità genomica, giustificata dal fatto che le regioni NTS sono ipervariabili e non coinvolte nel processo evolutivo. Queste ultime possono andare incontro ad un maggior numero di mutazioni e rimaneggiamenti (inserzioni/delezioni) senza incidere sulla fitness della specie. Dall’analisi dell’allineamento eseguito per i campioni SD e SS è possibile notare un elevato numero di gap riconducibili ad eventi di inserzione/delezione di porzioni della sequenza (Figura 4.3.1). È possibile osservare inoltre, alle estremità delle sequenze in prossimità dei nucleotidi riconosciuti dai due primers, porzioni con un alto grado si similarità.

Queste regioni risultano essere più conservate, data la loro vicinanza con la sequenza del gene 5S-rRNA. Sulla base di questa analisi è stata riscontrata inoltre la notevole diversità della sequenza SD dalla SS. In particolare quest’ultima risulta avere dimensioni maggiori (482 bp), questo può essere spiegato dal fatto che nel corso dell’evoluzione la specie SD abbia subito nella regione in questione un evento di delezione. Il risultati ottenuti finora non hanno purtroppo avuto esito positivo per il campione SP. Come si può vedere in Figura 4.1.1 la banda nella quarta lane, rappresentante l’amplificazione del DNA inserito nel plasmide eseguito con i primers esterni M13 forward e reverse, risulta di circa 400 bp, indice di una sequenza tronca, ipotesi confermata con i dati del sequenziamento. Non è stato quindi possibile eseguire allineamenti e alberi filogenetici per un’analisi comparativa con le altre due specie.

Il lavoro che viene qui presentato fa riferimento ad una prima analisi sperimentale del campione SP, facente parte di un progetto di ricerca più ampio, ci prefiggiamo quindi di ripetere le analisi su altri geni nel prossimo futuro per poter confermare l’ipotesi di appartenenza del campione al genere Salvia e poterlo meglio caratterizzare dal punto di vista biologico molecolare. È auspicabile effettuare analisi molecolari anche con la tecnica PCRAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) o con marcatori molecolari per poter meglio discriminare la specie e risalire ai parentali del campione in esame SP. La tecnica AFLP, offre vantaggi maggiori se paragonata con le altre tecniche quali RFLP e microsatelliti, infatti ha una più alta riproducibilità, risoluzione e sensibilità a livello dell’intero genoma (Mueller e Wolfenbarger, 1999); inoltre, non sono necessarie informazioni a priori per l’amplificazione (Meudt & Clarke 2007).

Pertanto la tecnica AFLP è estremamente utile nello studio dei taxa, inclusi batteri, funghi e piante, il cui corredo genomico di questi vari organismi è ancora ampiamente sconosciuto. S. desoleana per il suo corredo cromosomico, 2n = 44 (Diana Corrias, 1983), e per la corrispondenza morfologico-strutturale in qualche cromosoma rispetto a S. sclarea (2n = 22) è stata considerata (Atzei e Picci, 1982) come possibile derivata da quest’ultima per un processo di apoendemia; tuttavia, in accordo con Camarda (1984) si propende per una origine più antica di S. desoleana, origine che va piuttosto ipotizzata in progenitori comuni alle due specie ed oggi forse scomparsi.