Veicolazione tramite sistemi nanoparticellari lipidici solidi di molecole di interesse biologico

1 
1. INTRODUZIONE 
 
 
La progettazione e la realizzazione (drug discovery) di una molecola 
innovativa in campo farmaceutico viene definita, in gergo strettamente 
tecnico, come NCE (New Chemical Entity) e costituisce una delle 
principali attività di ricerca su cui le grandi multinazionali 
farmaceutiche investono ingenti capitali. 
Tuttavia il drug discovery è un percorso arduo e molto dispendioso: è 
stato stimato che la spesa totale per la ricerca e lo sviluppo 
farmaceutico a carico delle maggiori industrie farmaceutiche degli 
Stati Uniti d’America supera i 20 miliardi di dollari e, secondo le 
stime statistiche, questo dato è in continuo aumento
1
. 
Il costo medio per ogni nuova molecola ad attività biologica, da 
quando viene progettata e realizzata a quando giunge al consumatore 
finale, si aggira intorno ai 400 milioni di dollari (fig.1)
2-4
 e tutto il 
processo può richiedere piø di 14 anni di tempo
5
. 
 
 
 
                Figura 1: Fondi destinati allo sviluppo di NCE negli USA negli ultimi 10 anni
2 
 
Proprio a causa di questi alti costi di gestione e di questi ampi tempi di 
sviluppo le politiche economiche delle grandi aziende farmaceutiche 
sono gradualmente cambiate in risposta, soprattutto, alle enormi 
pressioni provenienti dai settori del marketing e dell’economia, che 
spingono verso una massimizzazione dell’efficienza dei principi attivi 
di nuova sintesi ed una minimizzazione dei tempi necessari alla loro 
immissione in commercio. Per tale motivazione, a partire dai primi 
anni ’90, sono state analizzate le diverse tappe che è necessario 
percorrere da quando un principio attivo è in fase di progettazione a 
quando può essere immesso nel circuito di vendita, al fine di capire 
dove fosse possibile apportare delle migliorie. 
Tale processo produttivo può essere diviso in diversi step
6
:  
 
 
• Identificazione del meccanismo biochimico che sta alla base 
dello sviluppo della patologia da trattare 
• Identificazione del target molecolare che regola tale 
meccanismo 
• Studi di drug design/docking molecolare 
• Creazione di una serie di composti potenzialmente attivi 
• Selezione e sviluppo di un composto Lead 
• Isolamento di una o piø molecole 
• Trials clinici
3 
Nelle prime fasi del periodo di sviluppo viene identificato un sito 
target di interesse farmacologico. Solo quando vi sono prove 
sufficienti per confermare la relazione tra questo bersaglio molecolare 
ed una malattia di interesse, vengono poi sintetizzati decine di nuovi 
composti e testati contro l'obiettivo. Di questi solo alcuni possiedono 
l'attività biologica desiderata e, dopo un primo screening, vengono 
sintetizzati degli analoghi strutturali che saranno ulteriormente testati 
per migliorarne l'attività ed ottimizzati numerosissime volte, al fine di 
individuare un piccolo numero di composti adatti ai test farmacologici 
su modelli in vivo. Alla fine restano in media solo pochi composti che 
saranno ottimizzati per ulteriori sviluppi e che entreranno nelle fasi 
della sperimentazione clinica. Sfortunatamente il 90% dei composti 
che entrano in queste fasi di sperimentazione vengono scartati per 
diversi motivi
7
. In particolare, uno studio condotto da Prentis e coll., 
dimostra che circa il 40% dei composti viene scartato a causa di uno 
scarso profilo farmacocinetico e che piø del 20% mostra tossicità 
correlata ad effetti collaterali dovuti ad una inadeguata 
biodistribuzione
8
. Questa attenta analisi ha portato allo sviluppo del 
Drug Delivery, un settore innovativo in campo farmaceutico che, 
soprattutto negli ultimi anni, sta assistendo ad una crescita e ad una 
diffusione nella comunità scientifica sempre maggiore. 
La filosofia che sta alla base di questo settore scientifico è quella di 
migliorare il profilo farmacocinetico delle molecole e, 
conseguentemente, di ridurne entro i limiti del possibile gli effetti 
collaterali ed i danni che ne conseguono. 
Inoltre, come sarà meglio descritto in seguito, il principio attivo può 
essere protetto dall’ambiente circostante e ciò consente anche 
l’impiego di molecole chimicamente labili altrimenti inutilizzabili.
4 
Infine, lo sviluppo di  sistemi di rilascio tecnologicamente avanzati, 
richiede costi relativamente contenuti se paragonati a quelli necessari 
per affrontare lo sviluppo di una NCE. 
Esistono numerosi sistemi di rilascio, definiti DDS (Drug Delivery 
Systems), che differiscono sia per le materie prime che li costituiscono 
(polimeri, lipidi, carboidrati ecc..), sia per le dimensioni che per i siti 
che il principio attivo deve raggiungere. In ogni caso il piø importante 
obiettivo che ci si propone è quello di veicolare il principio attivo 
direttamente sul sito bersaglio, limitandone la distribuzione su altri 
tessuti e garantendo la concentrazione minima efficace per uno 
specifico periodo di tempo. 
Le proprietà chimico-fisiche del principio attivo giocano un ruolo 
chiave nella progettazione di una formulazione a rilascio controllato 
ed è fondamentale effettuare degli studi preliminari accurati per 
determinare se tali proprietà sono compatibili con il distretto che si 
deve raggiungere. Generalmente si preferisce impiegare principi attivi 
allo stato solido in quanto sono chimicamente piø stabili e sono piø 
agevolmente lavorabili rispetto a sostanze in forma liquida. Tuttavia i 
farmaci solidi devono prima passare in soluzione nei liquidi fisiologici 
per poter espletare la loro azione biologica per cui devono possedere 
le giuste caratteristiche di solubilità e di stabilità in questi distretti. 
Bisogna tenere conto dei valori di pH e della forza ionica dei distretti 
interessati e delle caratteristiche di lipofilicità, in quanto sono tutte 
caratteristiche che influenzano drasticamente la solubilità di una 
sostanza. 
Una tipica caratterizzazione chimico-fisica preliminare prevede uno 
studio di stabilità del principio attivo in funzione della variazione di 
pH. Nel caso di farmaci allo stato solido vengono condotte sia delle
5 
analisi calorimetriche per determinarne il loro stato fisico (amorfo, 
cristallino, ecc..) che delle caratterizzazioni spettrofotometriche termo 
gravimetriche per determinarne la loro struttura chimica ed il grado di 
purezza
9
 .
6 
1.1 LIPOSOMI  
 
 
I liposomi costituiscono un potenziale drug carrier per una vasta serie 
di principi attivi, inclusi composti a basso peso molecolare, proteine 
ad azione terapeutica ed agenti diagnostici. La loro utilità terapeutica 
consiste nella possibilità di incorporare al loro interno dei principi 
attivi idrosolubili, che non sarebbero normalmente biodisponibili in 
quanto non verrebbero assorbiti a causa della loro scarsa interazione 
con i fosfolipidi delle membrane cellulari. In ogni caso possono essere 
veicolati anche farmaci di origine lipofila o sostanze con 
caratteristiche antipatiche, la cui parte lipofila si colloca all’interno del 
bilayer mentre la porzione idrofila si dispone all’interno dei 
compartimenti acquosi. I sistemi liposomiali si formano quando dei 
fosfolipidi, di origine sintetica o naturale, vengono dispersi in un 
mezzo acquoso
10
. In queste condizioni, infatti, si verificano delle 
interazioni dipolo-dipolo tra le teste polari delle catene fosfolipidiche 
e le molecole di acqua con una conseguente formazione di sistemi 
unilamellari o multilamellari sferici (vesicole) (fig. 2a).  Tali vescicole 
presentano una notevole analogia strutturale con il doppio strato 
lipidico caratteristico delle membrane biologiche e ciò conferisce loro 
una elevata biocompatibilità ed un alto grado di penetrabilità 
nell’ambiente intracellulare. 
La struttura chimica generale dei fosfolipidi è costituita dall’acido 
fosfatidico, un acido formato da un backbone di glicerolo in cui il 
gruppo idrossile in posizione 3 è esterificato con una molecola di 
acido fosforico, mentre i restanti gruppi idrossilici in posizione 1 e 2 
sono esterificati con acidi grassi di lunghezza variabile (fig. 2b). Il
7 
grado di lipofilia può essere definito in fase di progettazione sia 
modulando la lunghezza della catena degli acidi grassi esterificati in 
posizione 1 e 2, che scegliendo opportune molecole funzionalizzanti 
che possono essere esterificate su uno degli ossigeni disponibili 
dell’acido fosforico in posizione 1 del glicerolo (serina, 
etanolammina, colina, inositolo, ecc…). E’ possibile anche modificare 
la struttura tridimensionale delle vescicole. Aumentando la lunghezza 
delle catene di acidi grassi o inserendo delle  molecole di colesterolo
11
 
in fase di preparazione, ad esempio, si ottengono degli strati 
fosfolipidici piø sottili. Incrementano il grado di insaturazione o il 
grado di ramificazione o aumentando la temperatura in fase di 
formulazione, invece, si ottiene un minore grado di impacchettamento 
dei lipidi
12
. 
 
 
  
 
Figura 2: Struttura tridimensionale di una vescicola liposomiale (a) e dell’acido fosfatidico (b)
8 
Per la preparazione dei liposomi sono state sviluppate e testate 
numerose procedure, ma solo alcune di esse sono in grado di produrre 
dei sistemi in grado di incorporare principi attivi idrosolubili. Tra 
queste le piø usate sono la tecnica di evaporazione in fase inversa
13
, la 
tecnica dell’iniezione
14, 15
 o la tecnica  freeze-thaw
16
. Tutte queste 
tecniche consentono la formazione di strati uni lamellari o 
multilamellari ma devono essere applicate seguendo schemi elaborati 
ed ordinati in modo tale da ottenere sistemi il piø omogenei possibile. 
In questo modo, combinando diverse tecniche di preparazione 
all’impiego di fosfolipidi di diversa natura, è possibile ottenere una 
vasta gamma di sistemi liposomiali morfologicamente diversi ed adatti 
alla veicolazione in numerosi distretti biologici. Per questa 
motivazione i sistemi liposomiali possono essere classificati secondo 
diversi criteri. Una classificazione viene effettuata in base alla tecnica 
di preparazione adoperata per la loro realizzazione, tuttavia vengono 
piø comunemente classificati in base alle loro caratteristiche 
dimensionali e strutturali (fig. 3). 
 
                                                             
 
 
Figura 3: Classificazione generale dei liposomi 
SUV:           Small Unilamellar Vescicles 
LUV:           Large Unilamellar Vescicles 
MLV:          Multi Lamellar Vescicles 
MVV:         Multi Vescicular Vescicles 
OLV:           Oligo Lamellar Vescicles 
MLV-REV:  Mlv Reverse Phase Evaporation 
SPLV:          Stable Plurilamellar Vescicles                                       
FAT-MLV:  Freezing Thawing Mlv
9 
Oggi esistono in commercio alcune specialità medicinali basate 
sull’impiego di sistemi liposomiali. Ad esempio l’AMBISOME® è un 
prodotto liofilizzato, sterile ed apirogeno destinato ad un’infusione 
endovenosa. E’ costituito da liposomi unilamellari con un diametro 
inferiore ai 100 nm (SUV) contenenti Amfotericina B, un antimicotico 
a struttura anfotera intercalato tra i bilayer lipidico. Rispetto alla 
tradizionale formulazione, l’AMBISOME® risulta essere attivo a 
concentrazioni inferiori e presenta minori effetti tossici.
10 
1.2 IDROGEL 
 
 
Gli idrogel sono polimeri reticolati, tridimensionali e idrofilici, capaci 
di incorporare grandi quantità di acqua o di fluidi biologici
17, 18
. I 
reticoli sono composti da omopolimeri o copolimeri e sono insolubili 
in acqua a causa della presenza di legami chimici e fisici
19, 20
. Gli 
idrogel mostrano compatibilità termodinamica con l’acqua, che 
permette loro di rigonfiarsi nei mezzi acquosi (fig. 4)
17, 18, 21-23
. 
 
 
 
 
Figura 4: Fenomeno di swelling caratteristico degli idrogeli 
 
 
Esistono numerose applicazioni degli idrogel, in particolare nei settori 
medico e farmaceutico
24-26
. 
Gli idrogel assomigliano ai tessuti viventi naturali piø di ogni altra 
classe di biomateriali sintetici. Ciò è dovuto al loro alto contenuto in 
acqua ed alla consistenza soffice che è simile al tessuto naturale
24
. 
Inoltre, l’elevato contenuto di acqua di questi materiali contribuisce 
alla loro biocompatibilità. Quindi, gli idrogel possono essere usati per 
lenti a contatto, membrane per biosensori, materiali per pelle
11 
artificiale, e dispositivi per il rilascio di farmaci
24-28
. Gli idrogel 
possono essere classificati come neutri o ionici, in base alla natura dei 
loro gruppi funzionali in catena laterale. Inoltre in  base al metodo di 
preparazione utilizzato, si possono distinguere  networks 
omopolimerici o copolimerici. Infine possono essere classificati in 
base alla struttura fisica del reticolo come amorfi, semicristallini, 
strutture con legami ad idrogeno, strutture supramolecolari e aggregati 
idrocolloidali
17-20, 29-37
. Gli idrogel possono anche mostrare un 
comportamento di rigonfiamento dipendente dall’ambiente esterno. 
Questi polimeri sono idrogel a risposta fisiologica
38
, in cui i reticoli  
possono essere rotti o possono rigonfiarsi come risultato del 
cambiamento dell'ambiente esterno. Questi sistemi tendono a mostrare 
drastici cambiamenti nel loro rapporto di rigonfiamento. Alcuni dei 
fattori che influenzano il rigonfiamento o la risposta fisiologica degli 
idrogel includono pH, forza ionica, temperatura e radiazioni 
elettromagnetiche
38
. Un modo conveniente per classificare gli idrogel 
è basato sulla natura dei gruppi laterali; essi possono essere sia neutri 
che ionici. La natura chimica ed il numero di questi gruppi può essere 
ben controllato dalla scelta dei parametri usati nella sintesi polimerica. 
Un elenco dei monomeri piø comunemente usati nella preparazione 
dei materiali polimerici nel campo farmaceutico è indicato in Tabella 
1.
12 
 
 
Tabella 1: : Monomeri comunemente usati nella sintesi di idrogel per applicazioni farmaceutiche. 
 
 
Nuoivi materiali polimerici possono essere realizzati per risolvere 
specifici problemi nel rilascio dei farmaci 
39
. Quindi, materiali 
innovativi basati sull’impiego di polimeri come PHEMA, poli(N-
isopropilacrilammide)  (PNIPAAm), e poli(vinil alcol)  (PVA), sono 
sintetizzati principalmente attraverso tecniche di preparazione 
moderne ed innovative e nuovi monomeri sono stati preparati per la 
produzione di polimeri con le proprietà desiderate. 
Gli idrogel sono usati anche come carriers che possono interagire con 
la mucosa che riveste il tratto gastrointestinale, il colon, la vagina, il 
naso ed altre parti del corpo, a causa della loro abilità di prolungare il 
tempo di permanenza nel luogo di rilascio
40
. Si pensa che l’interazione 
tra tali carriers e le glicoproteine della mucosa avvenga 
principalmente attraverso legami ad idrogeno. Quindi, i materiali 
contenenti un’alta percentuale di gruppi carbossilici ed idrossilici 
appaiono promettenti per questo tipo di applicazioni.
13 
Uno dei piø importanti fattori che influenzano il rigonfiamento degli 
idrogel è l’entità della reticolazione, che è definita come il rapporto tra 
le moli dell’agente reticolante e le moli delle unità ripetitive del 
polimero. Piø tale valore è alto, piø l’agente reticolante è incorporato 
nella struttura dell’idrogel. Gli idrogel altamente reticolati hanno una 
struttura piø stretta, e si rigonfieranno meno, in confronto agli stessi 
idrogel con un rapporto di reticolazione piø basso. La reticolazione 
ostacola la mobilità delle catene polimeriche, quindi diminusce 
l’entità del rigonfiamento. Anche la struttura chimica del polimero 
può influenzare l’entità del rigonfiamento degli idrogel. Quelli  
contenenti gruppi idrofilici si rigonfiano maggiormente, rispetto a 
quelli contenenti gruppi idrofobici, poichØ i gruppi idrofobici 
collassano in presenza di acqua, minimizzando quindi la loro 
esposizione alle molecole di tale solvente.  Il rigonfiamento degli 
idrogel sensibili alle condizioni ambientali può essere influenzato da 
stimoli specifici. Il rigonfiamento degli idrogel temperatura-sensibili  
può essere influenzato da cambiamenti della temperatura del mezzo di 
rigonfiamento. La forza ionica ed il pH influenzano invece 
rispettivamente gli idrogel forza ionica-sensibili e pH-sensibili. 
Gli idrogel ambiente-sensibili sono in grado di rispondere ai 
cambiamenti del loro ambiente esterno. Essi possono esibire drastiche 
variazioni nel  comportamento di rigonfiamento, nella struttura 
reticolata, nella permeabilità e nella forza meccanica in risposta ai 
cambiamenti del pH, della forza ionica del fluido circostante o della 
temperatura
41
. Altri idrogel hanno la capacità di rispondere 
all’applicazione di campi elettrici o magnetici, o al cambiamento nella 
concentrazione del glucosio 
41
. A causa della loro natura, questi 
materiali possono essere usati in un’ampia varietà di applicazioni.
14 
Le proprietà meccaniche degli idrogel sono molto importanti per le 
applicazioni farmaceutiche. Ad esempio, l’integrità del dispositivo di 
rilascio del farmaco per la durata dell’applicazione è molto importante 
per ottenere l’approvazione della FDA, a meno che il dispositivo sia 
progettato come un sistema biodegradabile. Un sistema di rilascio del 
farmaco progettato per proteggere un agente terapeutico sensibile, 
come una proteina, deve mantenere la sua integrità, finchØ il principio 
attivo viene rilasciato completamente.