Valutazione di zebrafish come modello per analisi patogenetiche nella sindrome di Alagille.

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SOMMARIO  
 
La sindrome di Alagille (ALGS) è una malattia rara, autosomica dominante, che 
colpisce fegato, cuore, occhi, cartilagini facciali e vertebre. Nel 94% dei casi si 
riscontrano mutazioni nel gene JAG1 (ALGS1), mentre nell’ 1% degli affetti si 
trovano mutazioni in NOTCH2 (ALGS2). Il ligando Jagged1 ed il recettore Notch2 
appartengono entrambi alla via di segnale Notch. Questo progetto mira a 
valutare zebrafish come bio-sensore per la diagnosi molecolare di mutazioni 
umane candidate nella patogenesi di ALGS. A tale proposito, abbiamo messo a 
punto degli esperimenti che riproducessero la condizione di sovraespressione del 
messaggero Jagged1 umano selvatico, confrontando tale fenotipo con quello 
indotto dall’iniezione di forme mutate, al fine di delucidarne il meccanismo 
patogenetico. È infatti dibattuto se si tratti di dominanza negativa oppure 
aploinsufficienza. Per le nostre analisi ci siamo concentrati su distretti sensibili 
alla via di Notch quali sistema nervoso, notocorda e vasi. Abbiamo ottenuto 
risultati concordi con la letteratura per quanto riguarda l’iniezione del 
messaggero selvatico. Lo studio della mutazione pK945RfsX7 ha dimostrato che 
la corrispondente proteina tronca conserva solo parziale funzione biologica. In 
parallelo, abbiamo prodotto due linee transgeniche Notch-sensibili, le quali 
permetteranno di valutare in vivo forme mutate del messaggero JAGGED1 
umano.
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1. INTRODUZIONE 
1.1 DANIO RERIO COME SISTEMA MODELLO 
 
 
Figura 1: Esemplari di zebrafish adulti (femmina in alto e maschio in basso). 
Danio rerio, meglio conosciuto come zebrafish, è un piccolo pesce teleosteo 
appartenente alla famiglia dei Ciprinidi, adottato come sistema modello negli 
studi di ricerca biologica per le sue caratteristiche peculiari. Le sue dimensioni 
ridotte (3-4 cm) e le semplici esigenze alimentari ne facilitano la stabulazione ed 
il mantenimento.   
Gli accoppiamenti sono semplici da allestire e l’abbondante quantità di uova 
deposte da una femmina (circa 200 ad ogni evento riproduttivo) consentono 
analisi genetiche su larga scala. Un notevole vantaggio è rappresentato dalla 
fecondazione esterna. La trasparenza dell’embrione stesso nei primi stadi di 
sviluppo ne rende possibile la diretta osservazione al microscopio. La traslucenza 
dell’embrione è prolungabile artificialmente mediante l’aggiunta di PTU (1-fenil-
2-tiourea) al mezzo di crescita (fish water), garantendo in questo modo la 
possibilità di eseguire saggi di immunoistochimica o ibridazioni in situ su 
embrioni interi (W.I.S.H.). Inoltre, l’embrione di zebrafish ha dimensioni che ne 
permettono la manipolazione tramite tecniche di genetica inversa, 
sovraespressione o silenziamento genico.  La genetica inversa si basa sulla 
conoscenza iniziale del gene di interesse, per poi impiegare strategie differenti 
per parte da una molecola nota sia essa  DNA, mRNA o proteina,  e cerca di 
perturbarla, al fine di stabilire il ruolo del normale prodotto genico nella biologia 
dell’organismo. Considerando inoltre che l’embrione è permeabile a piccole 
molecole, alterazioni dei processi fisiologici di sviluppo possono essere indotti 
con aggiunta di sostanze teratogene all’acqua; in questo modo è possibile 
fenocopiare perturbazioni di specifiche vie di segnale a particolari stadi dello 
sviluppo. Infine, la somiglianza del programma di sviluppo tra tutti i vertebrati
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rende zebrafish un ottimo sistema modello per  investigare processi di sviluppo 
conservati tra varie specie.  
Il genoma, quasi completamente sequenziato dal Sanger Institute, è organizzato 
in 25 cromosomi (assetto aploide). Analisi comparative rivelano che molti geni di 
zebrafish presentano omologia con i geni dei mammiferi, uomo incluso. La 
similarità di sequenza si accompagna ad una elevata conservazione della 
sintenia, ovvero la conservazione dell’ordine lineare dei geni all’interno del 
cromosoma, e della funzione genica (geni ortologhi) (Barbazuk 2000).  
Nel corso dell’evoluzione, dopo la divergenza tra teleostei e tetrapodi, si è 
verificato un evento di duplicazione all’interno del genoma dei teleostei, 
fenomeno che ha portato alla formazione di copie multiple di una identica 
sequenza. La duplicazione di un gene porta alla comparsa di due copie di uno 
stesso gene. La duplicazione genica ha un notevole vantaggio evolutivo, poiché la 
copia superflua è libera di mutare trasformandosi nel tempo in un gene 
potenzialmente diverso da quello originario, senza alterare il fenotipo 
dell’individuo; infatti, il prodotto del gene funzionale assicura una normale 
attività biologica.  La duplicazione genica in zebrafish comporta notevoli 
potenzialità negli studi genetici, tra cui la possibilità di analizzare con precisione 
le funzioni dei due omologhi, anche annullando l’espressione di una delle due 
copie senza incorrere in fenotipi letali. 
In zebrafish è possibile applicare tecniche di mutagenesi. Nel caso di mutagenesi 
chimica, individui adulti di sesso maschile vengono immersi in acqua contenente 
N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) la quale induce mutazioni puntiformi casuali nella 
linea germinale. Questi individui vengono incrociati con femmine selvatiche così 
da dare origine ad una popolazione (F
1
) ricca di mutazioni puntiformi in 
eterozigosi. Se le mutazioni indotte sono dominanti, saranno individuabili a 
partire dalla generazione F
1.
 In seguito, i maschi della generazione F
1 
sono 
incrociati individualmente con femmine selvatiche ed i discendenti (F
2
) fatti 
incrociare tra loro. L’inincrocio fa sì che eventuali mutazioni recessive possano 
raggiungere l’omozigosi. 
 
A questo punto sarà possibile selezionare i mutanti 
mediante analisi fenotipica ed identificare il gene colpito in modo da 
caratterizzarne la funzione (Lieschke 2007; Nusslein 2002) 
In Danio rerio, a differenza dei mammiferi, non è possibile realizzare mutagenesi 
mediante tecniche di ricombinazione omologa; è attuabile invece la transgenesi 
nella linea germinale con l’uso di trasposoni non autonomi. I trasposoni sono 
elementi mobili di DNA delimitati da sequenze ripetute terminali; in generale un 
trasposone contiene i geni che codificano per le funzioni di trasposizione.  
In zebrafish è stato sviluppato un sistema di transgenesi che sfrutta i trasposoni: 
il sistema Tol2. Questa metodica prevede l’iniezione di un plasmide donatore
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contenente le sequenze di riconoscimento della trasposasi Tol2 fiancheggianti la 
cassetta del costrutto di interesse (elemento non autonomo), associate al 
messaggero sintetico della trasposasi Tol2 stessa. A seguito dell’iniezione 
nell’embrione, la trasposasi verrà tradotta a partire dal proprio messaggero,  e 
catalizzerà l’escissione del costrutto dal plasmide donatore e la conseguente 
integrazione nel genoma dell’ospite (Kawakami 2007; Kawan 2007). 
1.2 SVILUPPO EMBRIONALE DI ZEBRAFISH 
Il processo di sviluppo di Danio rerio è stato ampiamente studiato. Lo sviluppo, 
descritto in dettaglio da Kimmel e colleghi (1995), è considerato regolare se 
l’organismo viene allevato ad una temperatura di 28.5°C; è possibile accelerare il 
processo con un aumento di temperatura. 
Zebrafish si sviluppa da uova telolecitiche (gran parte dell’uovo è occupato da un 
abbondante tuorlo e le cellule sono confinate ad un polo della sfera) e 
meroblastiche (i solchi di divisione cellulare non attraversano il tuorlo, ma 
suddividono unicamente il blastodisco, una piccola regione priva di tuorlo 
allocata al polo animale dell’uovo). Questo specifico tipo di segmentazione 
meroblastica viene definita discoidale. Il contenuto del tuorlo nutre l’embrione. 
L’ingresso del gamete maschile nella cellula uovo è seguito da un influsso di 
calcio che modifica la permeabilità della membrana di quest’ultima, evitando la 
possibilità di una fecondazione multipla. Il calcio, inducendo riarrangiamenti 
citoscheletrici dei filamenti di actina, determina uno spostamento del citoplasma 
verso il polo animale, in posizione opposta al punto di entrata dello 
spermatozoo: lo zigote, dalla forma iniziale appiattita, diviene progressivamente 
cupoliforme.  
Dopo circa 45 minuti  avviene la prima divisione mitotica  giungendo alla stadio di 
blastula in un paio d’ore. Le divisioni segmentali dell’embrione dopo la 
fecondazione sono sincrone ed incomplete a causa della prevalenza del vitello e 
riguardano solo il blastodisco. Le cellule che vengono così a formarsi rimangono 
collegate al tuorlo mediante ponti citoplasmatici formando un unico sincizio: 
molecole di taglia inferiore ai 17k-Da possono passare liberamente da un 
blastomero al vicino. All’inizio della decima divisione cellulare inizia la 
trascrizione zigotica, la quale segna il passaggio detto “mid–blastula- transition" 
(MBT, tra le 2 e le 3 hpf); da questo momento le divisioni cellulari rallentano e 
divengono asincrone.  
A tale stadio sono distinguibili tre popolazioni cellulari:
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 Yolk syncitial layer (YSL)/cellule sinciziali del tuorlo: cellule collocate al 
bordo vegetale del blastoderma fuse con le cellule del tuorlo sottostante. 
 Enveloping layer (EVL)/ cellule del rivestimento: strato più superficiale ed 
esterno del blastoderma, disposte in un unico sottile strato. 
 Deep cells/ cellule profonde: cellule intermedie tra le due sopra citate, 
che andranno a formare l’embrione vero e proprio. 
La gastrulazione è l’insieme dei movimenti morfogenetici che portano i territori 
presuntivi nella loro sede definitiva. Essa si compone di epibolia ed embolia. 
L’epibolia è il primo movimento delle cellule del blastoderma, le deep cells si 
muovono verso l’esterno intercalandosi all’enveloping layer, do così da scorrere 
sopra il polo vegetale ed andare a circondare completamente il tuorlo. Quando le 
cellule dell’EVL si trovano molto vicine alle cellule YSL e formano un sottile strato 
attorno al tuorlo, inizia un secondo movimento cellulare; le EVL e le deep cells  
tornano molto velocemente verso la parte superiore del tuorlo mentre le YSL 
continuano a muoversi attorno al tuorlo. Questi movimenti portano alla 
formazione di due strati cellulari (definiti foglietti) sovrapposti, uno esterno 
(epiblasto, futuro ectoderma), ed uno interno (ipoblasto, futuro 
mesendoderma). Una volta formatosi l’ipoblasto, le cellule di quest’ultimo 
andranno ad intercalarsi con le cellule dell’epiblasto a livello del futuro lato 
dorsale, generando così un ispessimento definito scudo embrionale (embryonic 
shield), una struttura fondamentale nello stabilire la formazione dell’asse 
dorso/ventrale. Il mesendoderma si suddivide in due strati: mesoderma ed 
endoderma. L’embrione a questo stadio avrà tre distinti foglietti embrionali: 
ectoderma, mesoderma ed endoderma a partire da ciascuno dei quali hanno 
origine precise regioni anatomiche. Dall’ectoderma derivano sistema nervoso ed 
epidermide, il mesoderma dà origine a cuore, sangue, muscoli ed ossa; 
 
 
Figura 2: Rappresentazione grafica di 
una blastula prima della gastrulazione 
( Riadattato da Langeland and Kimmel 
1997).
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l’endoderma, infine, genera i vari tratti del tubo digerente e gli organi ad esso 
associati. 
A partire dalle 10 hpf e fino alle 24 hpf ha luogo il periodo di somitogenesi, 
durante la quale una serie di movimenti morfogenetici porterà alla formazione 
dei somiti.  Allo stadio di 24 hpf l’embrione assume un’evidente struttura 
bilaterale; l’osservazione al microscopio a dissezione permette di riconoscere gli 
occhi, gli otoliti, i somiti, i dotti pronefrici, e la notocorda. 
Tra le 36 e le 48 hpf (Pharyingula period), a partire da una regione ventrale, ha 
luogo la formazione dei sette archi faringei; iniziano a formarsi lateralmente due 
strisce di melanociti, gli abbozzi delle pinne e diverrà visibile la pompa cardiaca e 
la dinamica delle cellule del sangue. 
In genere entro le 72 hpf si ha la schiusa (Hatching period) e l’embrione esce dal 
corion; ordinariamente vengono definiti “embrioni” organismi fino a 3 giorni 
dopo la fecondazione; successivamente sono denominati “larve” natanti.  
 
Figura 3: rappresentazione dei principali stadi di sviluppo di zebrafish a partire da una cellula fino alle 24 
hpf. (Riadattata da Langeland and Kimmel 1997).
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1.3  LA VIA DI SEGNALE NOTCH  
La via di segnale Notch, dal punto di vista evolutivo, è altamente conservata ed è  
presente in molti organismi pluricellulari sia vertebrati che invertebrati; 
interviene in svariati processi dello sviluppo mediante tre meccanismi: istruttivo, 
permissivo o divisione asimmetrica (Lai 2004).          
 1.3.1 Struttura molecolare dei ligandi e dei recettori 
La via di segnale Notch si attiva in seguito all’interazione di cellule giustapposte 
di cui una esprime i recettori e l’altra i ligandi. 
 
Tabella 1: Tabella che riassume i componenti principali della via di segnale Notch in Homo Sapiens, Danio 
rerio, Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans. 
 Homo Sapiens 
(e tutti i mammiferi) 
Danio rerio Drosophila C. elegans 
Ligando Jagged 1 (JAG1) 
Jagged2 (JAG2) 
 
 
Delta-like 1 (DLL-1) 
Delta-like 3 (DLL-3) 
Delta-like 4 (DLL-4) 
jagged1a (jag1a) 
jagged1b (jag1b) 
jagged2 (jag2) 
 
deltaA 
deltaB 
deltaC 
deltaD 
Serrate 
 
 
 
Delta 
LAG-2 
DSL-1 
APZ-1 
Recettore Notch1 
Notch2 
Notch3 
Notch4 
notch1a 
notch1b 
notch2 
notch3 
Notch LIN-12 
GPL-1 
Figura 4: Struttura di Notch e dei suoi 
ligandi (rielaborata da Fiuza 2007).
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Il recettore Notch è un eterodimero transmembrana costituito da un’estesa 
porzione extracellulare ed una più piccola porzione intracellulare, unite da un 
legame non covalente calcio dipendente.   
La peculiarità di questo recettore è la sua duplice funzione: recettore trans-
membrana e fattore di trascrizione. Nella porzione extracellulare possiamo 
trovare 36 ripetizioni EFG-simili (Epidermal Growt factors – like)  ed in prossimità 
del dominio di eterodimerizzazione un dominio ricco in cisteina: Lin-12. Nella sua 
parte intracellulare Notch possiede nell’ordine: una regione chiamata RAM (RBP-
jk Associated Molecule) seguita da sette ripetizioni anchiriniche, necessarie per 
l’interazione con i co-attivatori nucleari CSL/CBF1/Su(H) (CBF1[C-promoter 
binding factor-1]/(RBP-jk)Su(H)/LAG1 family). Questo dominio è fiancheggiato da 
un segnale di localizzazione nucleare e di trans attivazione (TAD) ed infine il 
dominio PEST (un dominio ricco dei seguenti amminoacidi P: prolina, E: 
glutammato, S: serina, T: treonina) coinvolto nella successiva degradazione del 
recettore Notch.  
Contrariamente alla maggior parte delle vie di segnale, che sfruttano proteine 
diffusibili su medio-lunghe distanze, la via di Notch è una segnalazione cellula-
cellula, di tipo juxtacrino.  
I ligandi Jagged/Serrate e Delta sono monomeri, anch’essi proteine 
transmembrana, appartenenti alla famiglia DSL (Delta-Serrate-Lag ligands). Si 
compongono di un esteso dominio extracellulare, un dominio transmembrana ed 
una piccola porzione intracellulare. Il dominio extracellulare a sua volta è 
costituito da una porzione DSL (Delta-Serrate-Lag ligands), la quale media 
l’interazione con il recettore Notch, e da ripetizioni EGF – simili (Epidermal 
Growth factors – like)  le quali stabilizzano il legame ligando-recettore. Queste 
ripetizioni sono presenti in numero maggiore nei ligandi Jagged/Serrate. Inoltre, 
solo per i ligandi Jagged/Serrate è presente un dominio aggiuntivo ricco di 
cisteine (cisteine rich domain) (Fiuza 2007).