Valutazione di alcuni effetti dell'applicazione in serra e in campo di rizobatteri promotori della crescita, combinati con funghi micorrizzici arbuscolari

Riassunto 
L’ uso di PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria , Batteri promotori della crescita delle piante ) in 
agricoltura è stato studiato fin dall’ inizio e della metà del 20° secolo da ricercatori dell’ ex Unione sovietica 
e dell’ India su diverse colture, e quindi, successivamente, da ricercatori di tutto il mondo. I risultati dei 
primi esperimenti, spesso incoerenti, hanno fornito indizi riguardanti la condizioni ottimali per la 
colonizzazione batterica e la promozione della crescita di colture bersaglio. I benefici della crescita delle 
piante all'aggiunta di PGPR sono molteplici ed ora abbastanza noti. L'uso di PGPR inoculati per aumentare 
la resa delle colture è stato tuttavia  limitato a causa della variabilità e l'incoerenza dei risultati tra gli studi di 
laboratorio , in serra e in campo ma anche per il  tipo di preparazione dell’ inoculo, passo fondamentale per 
l’applicazione di tale biotecnologia.  
Obiettivo di questo studio è l’indagare sulla co-inoculazione di PGPR combinati con le micorrize 
arbuscolari, in campo, per valutare l’ effetto sinergico di un rapporto simbiotico tripartito per una produzione 
agricola sostenibile, onde limitare l’ uso di fertilizzanti chimici , dannosi per l ‘ambiente e per l’ uomo . I 
risultati finora ottenuti hanno convalidato l’ efficienza  sinergica dell’ applicazione di PGPR combinati ai 
funghi micorrizici  che interagiscono  tra di loro sulla crescita e sullo sviluppo delle piante tramite il 
miglioramento della nutrizione minerale ed un aumento della risposta nella pianta  agli stress abiotici e 
biotici .
L'applicazione dei  PGPR in agricoltura ed in orticoltura è stata studiata fin dall’ inizio e della metà del 20° 
secolo da ricercatori dell’ ex Unione sovietica e dell’ India su diverse colture . I risultati dei diversi 
esperimenti  erano spesso incoerenti per via della progettazione sperimentale  e della mancanza di 
conoscenza dei meccanismi  alla base della promozione della crescita  da parte dei rizobattersi sulle piante. 
Tuttavia  questi esperimenti sul campo hanno fornito indizi riguardanti le condizioni ottimali per la 
colonizzazione batterica e promozione della crescita di colture bersaglio  (Brown 1974 ). I benefici della 
crescita delle piante all'aggiunta di PGPR sono molteplici e saranno ampiamente discussi in seguito .  L'uso 
di PGPR per aumentare la resa delle colture è stato limitato a causa della variabilità e l'incoerenza dei 
risultati tra gli studi di laboratorio , in serra e in campo. C’è una grande quantità di informazioni, che sono 
però contraddittorie sull'efficacia della PGPR sulle piante in terreni in diverse condizioni di fertilizzazione: 
ad esempio l’ effetto di promozione della crescita indotto da  Azospirillum si verifica solo in condizioni di 
azoto limitato (Dobbelaere et al.2001; Fallik and Okon 1996 ). Tuttavia , in altri casi , i maggiori incrementi 
di promozione della crescita delle piante sono stati osservati dopo l'aggiunta di fertilizzanti (Okon and 
Labandera-Gonzalez 1994). Un altro modo in cui le specie di Azospirillum migliorano la crescita  è 
attraverso la produzione di acido indolacetico IAA ( Dobbelaere et al. 1999; Okon and Labandera-Gonzalez 
1994 ) . I risultati di  un  altro studio con frumento con inoculo di specie di Pseudomonas suggerivano che 
meno il terreno  è fertile , maggiore è la stimolazione della crescita delle piante da parte dei  PGPR. La 
promozione della crescita del mais con un ceppo di A. lipoferum è stato segnalata per essere indipendente dal 
tipo di coltura  o tipo di terreno nel campo (Fages1994 ).  
Quando  si sceglie un  PGPR efficace per l’ applicazione in un luogo specifico , è indispensabile considerare 
il livello  dei nutrienti essenziali nel suolo e come il PGPR potrebbe agire .In alcuni casi , ceppi specifici di 
batteri possono promuovere la crescita batterica solo in determinate colture . Ad esempio, si è riscontrato che 
su quattro  ceppi di Pseudomonas che hanno promosso la crescita di ravanello , uno solo è stato efficace nel 
promuovere la crescita delle patate. È stato anche osservato che i massimi incrementi in germinazione e in 
resa si verificano spesso nelle colture inoculate con ceppi isolati  dalla stessa rizosfera nativa della pianta  . 
Un altro aspetto cruciale è il numero di cellule del PGPR applicato, spesso di vitale importanza per 
un'adeguata promozione della crescita. Mentre ci può essere un numero  soglia di batteri che devono essere 
inoculati in una determinata coltura , un numero eccessivamente alto di batteri può essere nocivo per la 
germinazione e la crescita di semi o delle piante . Tuttavia  gli effetti della promozione della crescita possono 
verificarsi anche con popolazioni batteriche di scarsa entità .  
Un altro aspetto di interesse è la capacità di svernamento di PGPR che è fondamentale quando si considerano 
usi in climi più freddi . La sopravvivenza in climi freddi è legata alla produzione  di proteine antigelo di 
molti specie batteriche(Sun et al. 1995; Xu et al. 1998 ) .                                                                                                                                                          
Inoltre , è stato dimostrato che alcuni ceppi PGPR sono in grado di contrastare problemi di irrigazione 
riducendo l'effetto negativo di irrigazione delle colture con acqua altamente salina (Hamaoui
et al. 1996 )  . Ciò può riflettere l'abbassamento della pianta  di livelli elevati di etilene da stress salino 
mediante 1 - amino - ciclopropano - 1 - carbossilato ACC  deaminasi (Hall e al. 1996; Glick 2004;Gamalero 
et.al,  2009). 
Inoltre , è stato osservato che la popolazione batterica declina rapidamente nella rizosfera dopo l'inoculazione  
sebbene i suoi effetti durino per tutta la stagione di crescita. Diversi studi dimostrano che la promozione 
della crescita della pianta inoculata con i PGPR  si vede nelle prime fasi di sviluppo  e si traduce 
successivamente in rendimenti più elevati (Jacoud et al. 1998 ).                                                                                                                                                                            
La commercializzazione di PGPR  più comunemente usata è quella di Rhizobium spp  incorporati nella torba. 
Gli inoculi a base di torba , anche se a buon mercato e facilmente utilizzati , hanno molti svantaggi . La torba 
è generalmente utilizzata come mezzo non sterile e detiene un grande carico contaminante . Inoltre , la 
qualità della torba può essere variabile e la  torba stessa non è necessariamente facilmente disponibile in tutto 
il mondo .  Il calore di sterilizzazione della torba può rilasciare sostanze tossiche per i batteri scelti . Infatti  i 
Rhizobium ssp  sono vulnerabili a variazioni di temperatura e perciò hanno una durata limitata .                     
 
La conoscenza dei meccanismi di promozione della crescita è una aspetto fondamentale per la scelta del 
ceppo batterico inoculato alle piante in una determinata situazione .                                                                                                                 
La conoscenza più recente di meccanismi indiretti di promozione della crescita delle piante da batteri del 
suolo può aiutare la produzione agricola di alcune colture di leguminose . Il gas idrogeno che viene prodotto 
come un sottoprodotto nella fissazione di azoto da Rhizobium sp .entro noduli di leguminose può essere 
recuperato e riciclato dai ceppi che contengono un sistema di assorbimento di idrogeno ( Evans et al. 1987 ). 
È chiaramente vantaggioso per le piante avere azoto dal ceppo simbiotico tuttavia questa caratteristica non è 
comune a tutti i ceppi batterici rizosferici . Inoltre molti terreni contengono un gran numero di microrganismi 
viventi liberi in grado di catturare una parte del gas idrogeno prodotto durante la fissazione dell'azoto e, 
quindi, promuovere indirettamente la crescita delle piante trattate. In questi casi  i microrganismi 
responsabili di questo effetto di promozione della crescita della pianta  non sono stati identificati . I batteri 
viventi liberi diminuiscono l'interferenza nel processo di nodulazione da altri microrganismi del suolo . 
Questo è dovuto alla mancanza di studi comparativi tra le diverse colture e la varietà di batteri rizosferici . 
Per esempio, quando Pseudomonas putida GR12 - 2 viene inoculato su varie colture , ci sono differenze 
nella stimolazione, tra monocotiledoni e dicotiledoni . Ci sono anche significative differenze di rendimento 
in base alla stagione. Tuttavia ( come notato da Okon et al. 1994 ) gli  effetti  positivi di PGPR indicati su 
molte colture economicamente importanti sono reali , e questi risultati possono fungere da base per l'uso 
efficace di PGPR in agricoltura e in orticoltura (Bashan,1998, Lucy e alt. 2004).                                                                                                                                                                  
Il primo è legato al regolamento e il controllo della contaminazione degli inoculi commerciali .                   
Un inoculo dovrebbe in genere contenere un certo numero di batteri che però non può essere standardizzato 
perché varia in base alla specie batterica . I metodi di controllo per determinare il numero di batteri nell’ 
inoculo non sono neanche standardizzati . I metodi microbiologici più utilizzati sono i seguenti : il metodo 
della conta tradizionale su capsula e mediante identificazione  ELISA e immunoblot.
I regolamenti per il controllo della qualità e del numero degli inoculi differiscono a livello internazionale per 
cui gli inoculi variano da paese a paese .  Tuttavia vi è un’ agenzia governativa, l’ “ Agricolture Canada “ che 
ha continuamente regolato l’ uso degli  inoculi  nel corso degli ultimi vent’ anni . Lo standard più recente 
stabilito dall’ azienda per l’uso degli  inoculi di Rhizobium è tra il 10
3
 e 10
5 
 cfu per quanto riguarda le 
sementi mentre aumenta a 10 
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 per ettaro  per le piante ( Bordeleau and Prevost, 1981 ) . Dopo 
l’introduzione di regolamenti governativi oltre che in Canada, come dimostrato in precedenza ,  anche in altri 
paesi come in Australia e in Regno Unito vi è stato un miglioramento nella qualità degli inoculi commerciali. 
Nella maggior parte dei paesi non esiste però un regolamento standard per il controllo delle contaminazioni 
degli inoculi ,  in particolare quelli tradizionali di torba che sono i più utilizzati  . Gli inoculi a base di torba 
non sterile presentano infatti un numero minore di specie batteriche nell’ inoculo che è spesso  inefficiente  
perché  altre specie contaminanti possono prevalere  e avere effetti negativi. La sterilizzazione è un processo 
convalidato , ma la commercializzazione degli inoculi di torba sterile seppur ampiamente utilizzati hanno un 
prezzo superiore di  5 o di  10 volte rispetto agli inoculi non sterili  , per cui nella maggior parte dei casi si 
applicano questi ultimi, anche  perché non sono stati dimostrati effetti negativi sulla salute umana e sull’ 
ambiente .  
Il controllo delle contaminazioni , come i regolamenti  , variano da stato a stato . La Francia ha un 
regolamento più rigoroso della qualità dell’ inoculo che vieta totalmente le contaminazioni negli inoculi di 
Rhizobia ( Catroux , 1991 ) . In Australia si consente un basso livello di contaminanti (0,1% del totale della 
popolazione batterica ) ma si richiede un numero elevato di Rhizobia ( Thompson , 1991 ). In Ruanda 
prevede un basso livello di contaminanti  ammessi dello 0,001% e un numero elevato di Rhizobia ( Scaglia , 
1991 ) . In Usa e nel Regno Unito ( Smith , 1992 ) invece non sono presenti norme specifiche per il controllo 
dei contaminanti perché vari studi non hanno dimostrato effetti avversi nell’ uso di preparati di torba non 
sterili . La mancanza di un regolamento internazionale comune comporta uno svantaggio economico e 
soprattutto industriale agricolo . Il problema più rivelante in realtà è l’ introduzione e l’ accettazione degli 
inoculi in campo agricolo in quanto attualmente presentano una quota inferiore 1% sul mercato rispetto ad 
altri prodotti biologici come i bioinsetticidi a base di Barillus thuringiensis che hanno una quota del 90 % sul 
mercato . Tuttavia sonocommercializzati diversi inoculi tra cui, i primi sono stati: La Gold CoatTM inoculo 
di Rhizobium  basato  su vermiculite  ( Paau et al. 1991) , è un esempio di inoculo  liquido nei semi di soia,  u 
Nitragin @ Gold ( Smith 1995) un inoculo a base di polvere di argilla essiccata all'aria di erba medica ." 
Azogreen " , un inoculo a base di Azospirillum francese approvato ( Fages 1992) , Mycostop dalla Finlandia , 
uno dei primi biofungicidi basato su Streptomyces sp . ( Mohammadi , 1994a ; Mohammadi e Lahdenperä , 
1994b) , e il biofungicida " Kodiak " a base di Bacillus subtilis  . Molti altri vengono ora commercializzati in 
Europa ed in Italia.   
Un altro svantaggio è il tempo e la modalità dell’ applicazione dell’ inoculazione batterica .  
L’ applicazione del bioinoculo prevede una concomitanza con macchinari specifici e molti costosi e un 
metodo laborioso e a lungo termine di passaggi ulteriori alla semina in campo . Tale approccio non può 
sussistere soprattutto nelle zone temperate in campi di colture in un arco di tempo previsto molto limitato .