Validazione di una metodica HPLC per l’analisi di distamicina A cloridrato

PARTE INTRODUTTIVA
1. La cromatografia 
     La  cromatografia  fu  inventata  subito  dopo  l’inizio  del  secolo  dal  
botanico  russo  Mikhail  Tswett,  che  successivamente  la  impiegò  per  
separare  alcuni  pigmenti  vegetali,  quali  clorofille  e  xantofille.  La  
separazione  fu  ottenuta  facendo  passare  soluzioni  dei  pigmenti  
attraverso colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio finemente  
suddiviso. Le specie separate apparivano come bande colorate lungo la 
colonna e da questo esperimento deriva il nome che Tswett scelse per il  
metodo (in greco: chroma significa colore e graphein  significa scrivere) 
(Chromatography  and  Electrophotometric  Methods,  Part  A, 
Foundamentals, part B, Applications; 1983).
     Il termine cromatografia viene oggi utilizzato per indicare tutta una 
serie  di  tecniche  analitiche  di  separazione  di  una  miscela  nei  suoi  
componenti, basata sulla distribuzione differenziale dei vari componenti  
tra due fasi, di cui una fissa, detta anche fase stazionaria, e una mobile.
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Flusso di 
fase mobile
Sistema di iniezione
o deposizione
del campione
Colonna
Cromatografica
Sistema di rivelazione
o dei componenti
eluiti
     La  cromatografia  rappresenta  oggi  uno  dei  procedimenti  di 
separazione  più  efficaci,  nessun  altro  metodo  di  separazione  infatti  è 
così potente e di così generale applicabilità; la sua efficienza è di gran 
lunga  superiore  alla  distillazione  frazionata  o  alla  cristallizazione 
frazionata.
     In generale, il processo cromatografico può essere definito come un  
metodo fisico nel quale i componenti da separare vengono a distribuirsi 
tra due fasi, una fissa, detta stazionaria, costituita da un letto attraverso 
il quale si muove una seconda fase detta mobile.
     Il processo cromatografico è il risultato di una serie ripetuta di azioni  
di  adsorbimento  e  desadsorbimento  durante  il  movimento  dei 
componenti  di  un  campione  attraverso  la  fase  stazionaria,  e  la  
separazione è dovuta alla differenza nei coefficenti di distribuzione dei 
singoli componenti del campione  nelle  due  fasi,cioè  la  diversa  affinità 
dei componenti per ciascuna fase.
     Un  dispositivo  cromatografico  può  essere  schematizzato  con  il 
seguente schema a blocchi (Figura 1).
Figura 1
2.Classificazione delle tecniche cromatografiche 
     La  classificazione  delle  tecniche  cromatografiche  viene  fatta 
considerando le caratteristiche della  fase  fissa e  della  fase mobile,  le  
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quali chiaramente influenzano il tipo di meccanismo su cui si basa la  
distribuzione  dei  soluti  tra  le  due  fasi  ovvero,  in  ultima  analisi,  il 
processo separativo.
     La  fase  stazionaria  può  essere  disposta  in  una  colonna  
(cromatografia su colonna), e in questo caso la fase mobile è forzata a  
passare sotto pressione o per gravità. In alternativa la fase stazionaria  
può essere disposta su strato sottile (thin layer chromatography, TLC) e  
la  fase  mobile  si  muove  attraverso  la  fase  stazionaria  per  azione  di 
capillarità o sotto l’influenza della gravità.
     La fase stazionaria può essere solida o liquida. Nel caso in cui sia 
liquida viene distribuita su un supporto inerte di adatta granulometria o  
sulla carta; più di recente sono state introdotte fasi stazionarie non più 
semplicemente fatte aderire meccanicamente ma legate chimicamente al 
supporto inerte (fasi legate, Bonded Phase Chromatography, BPC).
     La  fase  mobile  può  essere  liquida  o  gassosa.  A  seconda  delle  
combinazioni  tra  i  vari  tipi  di  fase  mobile  e  stazionaria  le  diverse 
tecniche cromatografiche possono essere classificate in: 
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CROMATOGRAFIA
LIQUIDA (LC)
Liquido-Liquido (LLC)
Ripartizione
(Colonna, Carta, TLC, HPLC)
Liquido-Solido (LSC)
Adsorbimento
(Colonna, TLC, HPLC)
GASCROMATOGRAFIA (GC)
Gas-Liquido (GLC)
Ripartizione
Gas-Solido (GSC)
2.1. La cromatografia liquida 
     Nella Cromatografia Liquida la fase mobile è un liquido ed in base  
alla  fase  stazionaria  usata  e  al  processo  di  ripartizione  applicato  
esistono quattro processi distinti:
Cromatografia  di  ripartizione  liquido-liquido: la  fase  stazionaria  è 
rappresentata  da  un  liquido,  immiscibile  con  la  fase  mobile,  che 
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impregna  un  supporto  solido  inerte;  il  meccanismo  di  separazione  è 
basato sulla diversa ripartizione di due o più soluti tra le due fasi liquide.
     La cromatografia su carta può essere considerata una cromatografia  
di ripartizione in quanto la cellulosa si comporta da supporto inerte cui è  
sempre  legata  una  certa  quantità  di  acqua.  Durante  l’analisi  la  fase 
mobile  viene  adsorbita  sulla  cellulosa  ed  essa,  insieme  all’acqua  già 
legata al supporto di cellulosa, costituisce la fase stazionaria.
     Ovviamente le cromatografie di ripartizione possono essere eseguite 
su colonna o su strato sottile (TLC).
     La BPC (Bonded Phase Chromatography) è uno degli ultimi sviluppi  
nelle fasi stazionarie; in questo caso la fase stazionaria non si limita ad 
aderire  semplicemente  al  supporto  inerte  (silice  o  farina  fossile)  ma 
viene legata strutturalmente ad esso. Generalmente le fasi legate sono  
apolari oppure la loro polarità è minore di quella della fase mobile.
     Storicamente nei primi cromatografi liquidi la fase stazionaria era 
costituita da silice (materiale molto polare) e l’eluizione veniva effettuata  
con  solventi  apolari  o  poco  polari  poiché  con  solventi  polari  non  si  
verificherebbe  separazione  e  l’analita  fuoriuscirebbe  con  il  fronte  del 
solvente: in pratica la fase mobile era meno polare della fase fissa e 
questa situazione viene indicata come Cromatografia a Fase Normale.
     La BPC, rispetto alla cromatografia a fase normale, dispone di fasi 
fisse  apolari;  l’eluizione  in  questo  caso  deve  essere  effettuata  con 
solvemti  polari.  La  BPC,  nel  caso  in  cui  la  fase  stazionaria  sia 
effettivamente  meno  polare  della  fase  mobile,  viene  anche  chiamata  
Cromatografia a Fasi Inverse.
Cromatografia Liquido-Solido o Cromatografia di Adsorbimento: la fase 
stazionaria è rappresentata da un materiale solido costituito da particelle 
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con  grande  area  superficiale;  il  solido  qui  non  è  semplicemente  un 
supporto inerte, ma è in grado di adsorbire superficialmente i soluti. Il 
meccanismo  di  separazione  è  quindi  basato  sull’adsorbimento 
differenziale dei vari soluti. 
     I  materiali  utilizzati  per  la  fase  stazionaria  sono  allumina,  silice 
attivata  (la  si  attiva  mediante  riscaldamento  con  conseguente 
eliminazione dell’acqua adsorbita che impegnerebbe i siti attivi) e simili.
Cromatografia a Scambio Ionico: la fase stazionaria è costituita da un 
supporto  organico  con  gruppi  ionici  o  ionizzabili  legati  ad  essa  (ad  
esempio  -SO3-).  I  gruppi  ionici  della  resina  trattengono  mediante 
interazioni elettrostatiche i controioni di carica opposta i quali possono  
essere  poi  scambiati  con  gli  ioni  presenti  nella  fase  mobile.  Il  
meccanismo di separazione è basato quindi sulla diversa affinità che i 
vari controioni hanno nei confronti dei gruppi ionici della resina.
     L’eluente è in genere una soluzione contenente ioni scambiabili, la 
cui affinità per i gruppi ionici della resina deve essere inferiore a quella  
degli ioni da separare. Questa tecnica può essere utilizzata in ambito  
biochimico per separare ad esempio le proteine in base alla carica netta 
ad un certo pH.
Cromatografia  per  Esclusione  o  Cromatografia  per  Filtrazione  su  Gel  
(SEC): la fase stazionaria è costituita da un materiale poroso, con pori 
delle  dimensioni  delle  molecole  da  separare,  ne  sono  un  esempio  i 
setacci  molecolari  inorganici  tipo  zeoliti,  oppure  polimeri  organici  di  
porosità controllata, regolata dal grado di reticolazione.
     Le molecole più grandi sono escluse da tutti i pori mentre le più 
piccole  si  distribuiscono  nella  soluzione  acquosa  sia  all’interno  dei  
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granuli  sia  intorno  ad  essi.  In  questo  modo  le  molecole  grandi  si 
muovono  velocemente  attraverso  la  colonna  mentre  le  piccole  sono 
trattenute dalla fase stazionaria poiché permeano all’interno.
     Questa tecnica è utilizzata usualmente per separare macromolecole 
come polimeri, proteine, ecc.
     Per l’applicazione di queste tecniche viene utilizzato il cromatografo  
liquido ad elevata risoluzione.
     Oggi  la  cromatografia  liquida  su  colonna  si  identifica  con  la  
cromatografia  HPLC  (High  Performance,  o  High  Pressure  Liquid 
Chromatography).
     In HPLC sono utilizzate colonne chiuse, riutilizzabili, impaccate con 
materiali  di  granulometria  molto  fine  (5-10  μm)  e  controllata, 
aumentando quindi la superficie di contatto tra la fase mobile e la fissa e  
rendendo più omogeneo l’impaccamento. Questi miglioramenti rendono 
quindi possibile l’uso di colonne di dimensioni limitate, inoltre l’iniezione 
del  campione  è  resa  semplice  e  riproducibile  da  adatti  dispositivi  
(iniettori).
     Il flusso dell’eluente attraverso colonne a granulometria  così fine  
risulta estremamente lento per cui l’uso di queste colonne richiede che  
la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione (da cui High Pressure  
Liquid Chromatography). Con  l’impiego  di pompe particolari, capaci di 
applicare  pressioni  dell’ordine  di  50-150  atmosfere,  diventa  possibile 
ottenere  flussi  di  alcuni  millilitri  al  minuto,  sufficenti  a  permettere 
l’ottenimento dei cromatogrammi in tempi ragionevolmente brevi. 
     Le tecniche di rilevazione dei soluti nella soluzione eluita sono di tipo  
strumentale (rivelatori UV, a indice di rifrazione, ecc.).
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3.Il Processo Cromatografico
     Durante lo sviluppo di un cromatogramma vengono alla luce le due  
caratteristiche principali del processo cromatografico:
- migrazione  differenziale  lungo  la  colonna  dei  vari  composti 
contenuti nel campione;
- allargamento della banda che le molecole di ogni soluto occupano 
lungo la colonna man mano che esse migrano.
3.1.Migrazione Differenziale
     Il concetto di migrazione differenziale  dei soluti ed il concetto di 
selettività della colonna sono strettamente legati, infattil’efficacia di una  
colonna cromatografica come mezzo per separare due soluti dipende in 
parte  dalle  velocità  relative  a  cui  le  due  specie  sono  eluite.  Queste 
velocità  sono  a  loro  volta  determinate  dai  rapporti  di  ripartizione  dei  
soluti tra le due fasi.
     La  migrazione  differenziale  dei  soluti  sta  quindi  alla  base  del 
processo  di  separazione  cromatografico,  infatti  senza  differenza  nelle 
velocità di migrazione dei vari composti la separazione non è possibile.
     La  migrazione  differenziale  dei  soluti  deriva  dagli  equilibri  di 
distribuzione dei diversi composti (indicati con A e B nella figura 2) fra  
le particelle della fase stazionaria e l’eluente liquido che costituisce la  
fase mobile.
  
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Figura 2.   Separazione  ipotetica  di  una  miscela  dei  componenti  A e  B  mediante 
eluizione cromatografica su colonna e relativo segnale di uscita del rivelatore ai vari 
stadi di eluizione.
     La  velocità  con  cui il  composto  X si muove  lungo  la  colonna  è 
determinata dalla frazione di molecole del composto che si trovano nella  
fase mobile ad ogni istante, poiché le molecole di soluto sono impegnate 
in interazioni con la fase stazionaria.
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