Un ambiente informatica per la valutazione dei geni rilevanti in un processo di valutazione di microarray dataset

INTRODUZIONE 
 
 
I microarray sono uno strumento importantissimo delle così dette nanotecnologie. Introdotto 
nel 1996, sono tutt’ora diventati uno strumento affidale e preciso per lo studio 
dell’espressione genica.  
L’ultimo decennio ha visto l’implementazione e la diffusione di numerosi package per 
l’analisi di questa tipologia di dati. Di massima, i package, possono essere classificati in tre 
grandi categorie.  
La prima categoria è orientata all’operatore medico e permette di effettuare operazioni di 
definizione e regolarizzazione dell’immagine grafica fino ad estrarre da essa i dati 
campionati. 
La seconda categoria comprende metodi per affinare i dati numerici normalizzandoli rispetto 
ai valori fuori range o definendo un intervallo di tolleranza al di fuori del quale il dato è 
considerato non valido. 
La terza categoria, prevalentemente rivolta agli operatori informatici, supporta la definizione 
di algoritmi per effettuare operazioni di ranking e di classificazione, cioè per definire quali 
geni sono veramente rilevanti rispetto ad una data patologia. 
 
Spesso tali packages sono di tipo generale e necessitano di essere personalizzati con 
procedure “ad hoc” che consentono all’operatore che utilizza il package di effettuare 
agevolmente alcune operazioni ricorrenti. 
 
Questa tesi si propone di presentare due procedure: una che supporta il processo ricorrente di 
selezione ed abbinamento non manuale di un insieme di geni già pesati da un processo di 
ranking; la seconda che permette di valutare e confrontare i geni ritenuti rilevanti da diversi 
algoritmi di feature selection (questi risultati verranno successivamente usati dai biologi). 
Per inquadrare meglio l’argomento verrà inizialmente presentata una descrizione dello 
sviluppo della stessa tecnologia dei microarray. 
Verranno quindi analizzate le singole fasi che portano alla nascita dei data set provenienti 
dalla lettura dei microarray: si partirà dalla nascita dei microarray vero e proprio per poi 
continuare con la presentazione dei vari metodi di normalizzazione, di feature selection e dei 
metodi di classificazione. 
Nella seconda parte della tesi verrà presentata e descritta un’applicazione scritta in Java, che 
ha principalmente due diversi scopi: 
1. Acquisire un numero notevole di dati provenienti da una procedura di ranking e di 
mettere a disposizione all’utente un ambiente informatico con un interfaccia user-
friendly per la combinazione di gruppi di geni ritenuti più significativi ai fini 
diagnostici. 
2. Confrontare i dati ottenuti attraverso l’uso di diversi metodi di classificazione. 
 
 
 
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MICROARRAY 
 
 
 
Nel 1975 Edwin Southern riuscì a dimostrare che era possibile fissare su un supporto solido 
del DNA. Successivamente, nel 1991 per opera di Fodor, nacquero i primi microarray che 
fissavano su una superficie di vetro degli oligonucleotidi.  
Gli studi sull’espressione genica cercano di determinare la quantità di RNA messaggero 
trascritto nel sistema biologico di riferimento. L’uso di questa tecnologia riveste grande 
importanza nello studio di malattie caratterizzate da particolari alterazioni geniche dalle quali 
possono dipendere sia l’avanzamento della malattia, sia l’efficacia dei farmaci. Confrontando 
l’espressione genica di migliaia di geni di individui affetti da patologie diverse è possibile 
individuare geni differenzialmente espressi, e quindi potenzialmente responsabili delle 
diversità nei gruppi. 
 
I microarray (conosciuti anche come gene chip) sono un piccolo supporto solido, costituito 
generalmente da vetro, per l’analisi nei quali sono fissati su linee parallele e in posizioni 
prestabilite decine, centinaia o addirittura migliaia di puntini (detti anche spots), costituiti da 
microscopiche sonde di DNA.  
In generale possiamo vedere il microarray come un piccolissimo sistema che permette, grazie 
all’utilizzo di diversi supporti solidi, di determinare in maniera parallela o addirittura nel 
medesimo istante, migliaia di eventi biologici letti da uno scanner e visualizzati attraverso il 
monitor di un personal computer, che tra l’altro da la possibilità di avere i risultati in maniera 
numerica, agevolando, di fatto, l’analisi degli stessi. 
 
Nell’analisi dei microarray riveste grande rilevanza il fatto che siano dei sistemi ordinati. 
Infatti, ogni spot, detto anche probe o chip, è disposto in maniera ordinata e precisa 
all’interno del microarray, lungo linee orizzontali o verticali: questa caratteristica offre 
innumerevoli vantaggi;due tra i più importanti sono sicuramente quelli legati ai costi di 
produzione e alla velocità di lettura.  
Ogni elemento, quindi, deve essere disposto in maniera uniforme e equispaziato l’uno 
dall’altro.  
 
I probes possono essere costituiti da “prodotti” diversi: possono essere interi geni, porzioni di 
geni, come DNA, cDNA, mRNA, anticorpi, proteine, o addirittura porzioni di tessuti 
cellulari. 
 
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Ogni spot è costituito da due molecole diverse: la molecola sonda e la molecola target. La 
prima è parte costituente e caratterizzante della specificità del microarray; essa può essere 
costituita da acidi nucleici come RNA o DNA, oligonucleotidi, proteine, in grado di 
riconoscere e legare la seconda molecola che rappresenta l’elemento biologico da ricercare 
nel campione in esame. 
La pratica di usare acidi nucleici come sonda è sicuramente quella più diffusa; i primi 
esperimenti furono condotti attraverso l’utilizzo sì spots noti come cDNA microarrays. 
Oltre ai cDNA sono comunemente usati anche gli oligonucleotidi, che non sono altro che 
corte catene singole di DNA o RNA, le proteine, e addirittura intere cellule. 
I target sono i campioni da fare interagire. In tutti i casi, sia per gli acidi nucleici che per le 
proteine, è necessario preparare i campioni per poi legarli ad una molecola rivelatrice che 
nella stragrande parte dei casi è un colore fluorescente. A seguito della formazione del 
legame tra sonda e target si genera un segnale luminoso, il cui colore e intensità sono letti 
da uno scanner, e successivamente elaborati da un software e quindi interpretati 
dall’operatore. 
Come abbiamo avuto modo di affermare poco fa, per poter vedere il formarsi di un legame 
tra probe e target sono usati dei colori fluorescenti: la fluorescenza, infatti, è il tipo di segnale 
luminoso utilizzato per dare la possibilità ai dati del microarray di poter essere visualizzati e 
letti. Esso presenta innumerevoli vantaggi, quali la facilità d’uso, può essere di svariati 
colori, è compatibile con gli enzimi ed offre una risposta in tempi brevissimi. Con i moderni 
strumenti si riesce a distinguere tra segnali deboli molto ravvicinati tra loro e segnali più 
intensi: questo rende possibile aumentare la densità dei probes o spot. 
 
I microarray a DNA, detti anche DNA chip, sono uno strumento molto importante per lo 
studio dell’espressione genica su vasta scala.  
Con il termine espressione genica si intende il processo attraverso il quale l’informazione 
contenuta in un gene (costituita da DNA) è trasformata in una macromolecola funzionale, che 
tipicamente prende la forma di una proteina, o di un altro tipo di acido nucleico noto come 
RNA.  
Per le cellule la regolazione dell’espressione genica riveste un ruolo fondamentale, in quanto 
le permette di controllare le proprie funzioni interne ed esterne. 
 
Nei microarray a DNA, in ogni locazione, è depositato un gene che è composto da diverse 
coppie di un filamento di DNA. Questi filamenti sono utilizzati come sonde per misurare la 
quantità di altre molecole di DNA derivate dai trascritti di mRNA e contenute in una 
soluzione che è depositata sulla superficie del microarray.  
In biologia la trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute 
all’interno del DNA sono trascritte in una molecola di RNA. Con il termine mRNA si intende 
un tipo di RNA che codifica e porta l’informazione durante la trascrizione, cioè permette di 
fare una ”copia” del contenuto informativo presente nel DNA nell’RNA. 
 
 
1.1 NASCITA DEI MICROARRAY 
 
Per poter capire a fondo la tecnologia e le tecniche che stanno alla base della creazione dei 
microarray è utili fare un passo indietro, più precisamente nel 2002, quando venne dichiarato 
che il genoma umano era stato (quasi) completamente letto. 
Il problema a questo punto era riuscire a capire in che modo quella mole di dati che ora era 
possibile leggere, doveva essere interpretata.  
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Alla fine del 2002 si era quindi giunti a riconoscere la sequenza completa di qualche gene; 
leggendo tale sequenza si poteva quindi arrivare a trovare i caratteri comuni a tutti o a molti 
geni. Proprio per questo motivo furono creati dei software in grado di leggere l’intero DNA 
alla ricerca di nuovi geni, sulla base dei caratteri comuni che era stato possibile studiare sino 
ad allora. 
Gli studi sino a qui avevano solamente portato alla scoperta di qualche gene; un gene per 
poter essere utile alla cellula deve essere “copiato” in RNA, il quale sarà in seguito tradotto 
in proteine. Riuscire a misurare la quantità di RNA, significava quindi riuscire a capire quale 
era la funzione del gene stesso. Un meccanismo simile esisteva già, ma permetteva lo studio 
di un solo gene alla volta: l’idea era quindi quella di poter studiare l’espressione di ciascun 
gene conosciuto in un solo esperimento.  
 
Il DNA ha come caratteristica primaria quella di essere composte da una doppia elica, che se 
separate si accoppiano nuovamente spontaneamente formando sempre le coppie A-T e G-C; 
tale associazione avverrà solamente se le due sequenze sono perfettamente complementari. 
Una certa sequenza di DNA può essere dunque utilizzata come “sonda” per trovare altre 
sequenze a lei complementare.  
L’idea era quindi quella di sintetizzare migliaia di copie di un frammento di un gene insieme 
con altrettante copie sintetizzate di un gene diverso, ovviamente utilizzando uno spazio 
ridottissimo. Le sonde furono organizzate in delle griglie, dove ogni celletta conteneva una 
diversa sonda, permettendo quindi di poter leggere, in un solo esperimento, 
l’espressione genica di tutte le cellule studiate.  
A questo punto era quindi possibile dopo la creazione del vetrino, estrarre l’RNA dalle 
cellule studiate, trascrivere l’RNA in DNA e marcarlo con un prodotto fluorescente. Con le 
giuste condizioni ogni RNA si assocerà alla propria sonda, dando come risposta un 
determinato valore di fluorescenza, che risulterà proporzionale al numero di RNA che si sono 
associati alle sonde. Confrontando i dati ottenuti con altri esperimenti effettuati è possibile 
stabilire i geni specifici di ogni tessuto.  
 
Oggi giorno i microarray non trovano applicazione solamente nello studio dell’espressione 
genica, ma anche per analizzare la risposta a diversi tipi di stress o la malignità di un 
determinato tumore. 
 
Un secondo ambito dove la tecnologia dei microarray trova spazio deriva proprio dalla 
peculiarità della stessa strategia. Infatti, come è già stato detto, la sonda è capace di associarsi 
alla sequenza complementare solo nell’ipotesi che la complementarietà sia totale. Si è 
verificato l’esistenza di numerose differenze genetiche tra due diversi individui, fattore che 
dovrebbe portare a una quasi totale assenza di fluorescenza. Questi tipi di cambiamenti si 
verificano soltanto in una lettera (un nucleotide) che è chiamata SNP (Sigle Nucleotide 
Polymorphsm): l’idea fu quella di fabbricare per ogni posizione del DNA quattro sonde 
identiche, tranne che per la posizione in studio che prenderanno rispettivamente le quattro 
lettere del DNA.  
Ovviamente con questo meccanismo ci si aspetta che solamente una (o al massimo due) 
sonda dia il colore fluorescente; grazie a questa tecnica quindi è possibile risequenziare 
l’intero DNA di un individuo semplicemente andando a verificare quale sonda da il migliore 
segnale.  
 
 
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