Riassunto
- IV-
La prima parte di questa tesi è stata volta alla ricerca e messa
a punto di un metodo quantitativo, la Real Time PCR, per lo studio
di espressione di geni mitocondriali. Tale metodo consente la
quantificazione di mRNA a partire da ridotte quantità di materiale
di partenza (=1µg). Infatti una delle ragioni che limita tali studi su
tessuti umani è la necessità di ottenere dal tessuto quantità elevate
di RNA (>10µg) e, di conseguenza, di effettuare prelievi invasivi.
Il metodo da noi definito ha gli ulteriori vantaggi di essere
automatizzato e di utilizzare un sistema chiuso; questo riduce
notevolmente le possibilità di errore e le variabili incidenti.
La seconda parte della ricerca è stata incentrata sulla
quantificazione dell’mRNA dei geni che codificano per alcune
subunità (ND 1, ND 5, Cox I, Cox III) dei complessi I e IV della
catena respiratoria, nei mitocondri delle piastrine, al fine di
confrontare soggetti sani di entrambi i sessi di età inferiore a 25
anni e maggiore di 68.
Sono state scelte le piastrine come obiettivo di studio per
numerosi motivi. Innanzi tutto perché recentemente sono state
proposte come biomarkers dell’invecchiamento e sono state
considerate, a causa delle loro numerose proprietà biochimiche, un
utile modello per le cellule neuronali. Inoltre le piastrine sono prive
di nucleo e sono facilmente reperibili senza l’ausilio di tecniche
bioptiche.
I dati ottenuti mostrano che, sia in soggetti anziani che
giovani, allo stato stazionario, la quantità di trascritto di COX III è
la metà di COX I; al contrario la quantità di trascritti di ND 1 e ND
5 è raddoppiata nei soggetti anziani rispetto a quelli giovani.
Numerosi studi mostrano come tutta l’espressione
mitocondriale sia finemente regolata da meccanismi mitocondriali e
nucleari di cui però non si conoscono i dettagli. I nostri dati vanno
Riassunto
- V-
ad aggiungere un interessante tassello al mosaico poco chiaro della
regolazione della trascrizione.
La diversa espressione dei vari geni studiati in questa tesi può
essere riconducibile ad una differente stabilità dei trascritti,
probabilmente regolata da qualche fattore nucleare non ancora noto.
Le differenze significative riscontrate nei geni del Complesso I
della catena respiratoria (ND 1 e ND 5) tra giovani e anziani, si
possono interpretare come risposta della cellula alla diminuita
funzionalità mitocondriale già documenta nell’invecchiamento.
Infatti sappiamo che il Complesso I costituisce la tappa limitante
della respirazione mitocondriale e possiamo ipotizzare che
l’aumento di trascritto di tali geni rappresenti l’aumento della
sintesi di tutte le subunità del Complesso I.
Le prospettive future di questo studio prevedono l’impiego
della tecnica sviluppata per l’analisi di tutti gli altri geni codificati
dal mtDNA al fine di chiarire i meccanismi che regolano la
trascrizione e di individuare eventuali markers per
l’invecchiamento, o per patologie neurodegenerative, utilizzabili in
diagnostica.
TABELLA DELLE ABBREVIAZIONI UTILIZZATE:
Co Q Coenzima Q
Cox Citocromo Ossidasi
Ct Threshold cycle
DTT Di-tio-treitolo
dNTPs Deossinucleotidi
EDTA acido etilen - diammino - tetracetico
GAPDH Gliceraldeide - 3 - fosfato deidrogenasi
M-MLV RT Molony Murine Leukemia Virus Retro - Trascrittasi
mtDNA DNA mitocondriale
mTERF Fattore mitocondriale di terminazione della trascrizione
ND NADH Deidrogenasi
nDNA DNA nucleare
PRP Plasma ricco di piastrine
ROS Specie reattive dell’ossigeno
SDS Sodio dodecil solfato
TAE Tris – acetato + EDTA
TE Tris + EDTA
Tris Tris – idrossimetil - aminometano
UMM Universal Master Mix
Cap. 1 – Introduzione
- 1 -
1. INTRODUZIONE:
1.1 I mitocondri:
I mitocondri sono organelli di forma e dimensioni variabili in
relazione al loro stato funzionale, ma normalmente allungati (2-
10µm). Sono presenti all’interno di ogni cellula in numero
variabile: da 3 – 4 per ogni piastrina, fino a 1000 – 2000 per
epatocita.
Sono caratterizzati dalla presenza di una membrana esterna
ed una interna, entro le quali è rinchiusa la matrice mitocondriale.
La membrana esterna è permeabile a molecole fino a 10000 daltons,
grazie alla presenza di pori. La membrana interna, invece, è
impermeabile alla maggior parte degli ioni di piccole dimensioni e
presenta molti ripiegamenti (cristae), che hanno lo scopo di
aumentarne la superficie. Essa contiene gli enzimi deputati al
trasporto di elettroni ed alla fosforilazione ossidativa, oltre a varie
proteine di trasporto di metaboliti da e per la matrice.
La matrice mitocondriale appare come una sostanza
semisolida, di consistenza gelatinosa. In essa sono presenti gli
enzimi dell’ossidazione degli acidi grassi e del piruvato, quelli del
ciclo di Krebs, la glutammico deidrogenasi ed altri del metabolismo
aminoacidico. L’azione di tali enzimi è indispensabile per la
produzione, da substrati ossidabili, di equivalenti riducenti
trasferibili alla catena respiratoria.
Cap. 1 – Introduzione
- 2 -
Il mitocondrio è l’unico organulo, oltre al nucleo, dotato di
un proprio patrimonio genetico (mtDNA).
1.1.1. Il DNA mitocondriale (mt DNA):
Il mtDNA (Wallace, 1992) contiene 16.569 paia di basi,
consiste in due catene circolari, una pesante (H, con prevalenza di
basi puriniche, A e G) e una leggera (L, con prevalenza di basi
pirimidiniche C e T). La catena H contiene la maggior parte dei
geni.
I geni sono compatti (senza introni) e solo la regione di 1024
bp denominata D-loop (D come “dislocazione” in quanto le catene
H e L sono qui distaccate per la presenza di RNA quiescente) non
contiene geni, ma è deputata alla regolazione del mtDNA.
Il mtDNA contiene 37 geni: 22 geni per tRNA, 2 per RNA
ribosomiale (12s e 16s) e 13 geni che codificano per polipeptidi. I
13 polipeptidi fanno tutti parte della catena respiratoria localizzata
nella membrana mitocondriale interna.
Fig 1.1: Il mitocondrio
Creste Matrice
Spazio
intermembrana
Membrana
esterna
Membrana
interna
Cap. 1 – Introduzione
- 3 -
In particolare, si tratta di geni codificanti subunità del
Complesso I (7 subunità: ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5,
ND6), Complesso III (1 subunità: citocromo b), Complesso IV (3
subunità: COX I, COX II, COX III) e il Complesso V (2 subunità:
ATPasi 6 ed ATPasi 8).
I mitocondri sintetizzano solo alcune proteine della catena
respiratoria, e infatti ciascuno dei suddetti complessi contiene anche
subunità codificate dal DNA nucleare. I prodotti codificati da geni
dell’nDNA sono importati dal citoplasma e vengono assemblati con
le subunità codificate dal mtDNA.
I geni sono letteralmente attaccati l’uno all’altro, o separati
solo da pochi nucleotidi, per cui non esistono regioni non
codificanti e quasi tutte le sequenze codificanti non contengono
regioni laterali non tradotte (Montoya et al, 1981).
Un’altra peculiarità è la distribuzione in maniera sparsa dei
geni per i tRNA, che sono disposti a separare in maniera regolare i
geni per gli rRNA e per le proteine. I tRNA così distribuiti
sembrano avere una funzione di segnale per gli enzimi che
processano gli mRNA e che danno origine a mRNA maturi.
Infine alcuni geni per i tRNA uniscono alla duplice funzione
codificante e di segnale di terminazione, una terza funzione
regolatoria, in quanto contengono sequenze importanti per l’inizio
della sintesi del filamento L o per la terminazione della trascrizione
di alcuni rRNA.
Il mtDNA è aploide e non subisce ricombinazione. Viene
ereditato in modo madre-lineare (Cann et al, 1992; Wallace et al,
1995),
A causa della scarsa disponibilità di meccanismi di
riparazione (Clayton et al, 1974) e dell’assenza di proteine istoniche
Cap. 1 – Introduzione
- 4 -
il DNA mitocondriale è altamente variabile, specialmente nella
regione del D-loop (Parson et al, 1998), con un tasso di mutazione
7-10 volte più elevato che nel DNA nucleare.
La replicazione del mtDNA inizia nel D-loop con la catena
H. Essa viene replicata dalla polimerasi γ a partire dall’origine OH
(ore 12) e la catena figlia si forma in senso orario separando le due
catene H e L e arriva fino alle ore 8 che è l’origine della
replicazione della catena L (OL) e procede in senso antiorario.
Quando le catene figlie sono complete (circa 2 ore), esse si
separano e formano una nuova molecola. La replicazione del
mitDNA è quindi un processo bidirezionale ed asincrono.
Fig. 1.1.1: Il mtDNA
Cap. 1 – Introduzione
- 5 -
1.1.2 La trascrizione e traduzione del mtDNA:
La trascrizione del mtDNA è differente rispetto al nDNA
(geni trascritti individualmente controllati da geni promotori e
iniziatori separati).
Essa è articolata in maniera unica, corrispondente
all’organizzazione estremamente economica e compatta
dell’mtDNA dei mammiferi. I geni mitocondriali sono trascritti da
ciascuna catena come molecole policistroniche di mRNA, a partire
da promotori localizzati nella regione del D-loop (HSP ed LSP =
heavy e light strand promoter).
L’esistenza di un’unità di trascrizione, che si estende per tutto
il filamento H e di un’altra, che si estende per tutto il filamento L,
ha come risultato la trascrizione completa e simmetrica di questo
DNA; un fenomeno scoperto circa 20 anni fa e che fino ad ora
rimane unico (Murphy et al, 1975).
Quando le nucleasi endogene tagliano i tRNA alle due
estremità di ogni gene, liberano contestualmente anche tutte le altre
specie di mtRNA.
Poiché per la sintesi proteica servono molte più copie di
rRNA che di mRNA, si sono sviluppate due forme alternative di
trascrizione della catena H (con due punti di origine molto vicini tra
loro). Da H
2
la trascrizione procede per tutto l’anello, mentre da H
1
si ferma alla fine dei due geni per gli rRNA (a livello del tRNA leu
(UUR) a cui si lega un fattore proteico per bloccare la trascrizione).
Ciò permette di arricchire il pool di rRNA (da 15 a 60 volte
maggiore) a spese degli mRNA.
Le fasi di processamento dell’mRNA comprendono la
poliadenilazione degli mRNA (sequenza breve per gli rRNA e
lunga per gli mRNA).
Cap. 1 – Introduzione
- 6 -
I tRNA subiscono una modificazione post-trascizionale che
consiste nell’aggiunta di CCA all’estremo 3’ e nella modificazione
di basi specifiche (Ojala et al, 1981).
La traduzione avviene su ribosomi mitocondriali 55S
(costituiti da una subunità 39S e 28S che contengono
rispettivamente rRNA 16S e 12S codificati dal mtDNA).
Sono richiesti i 22 tRNA (anziché i previsti 24) codificati dal
mtDNA, una batteria di aminoacil-tRNA sintetasi e vari fattori di
iniziazione ed allungamento. Le specificità dei tRNA codificati dal
mtDNA sono differenti dal nDNA (DNA nucleare): vi sono
differenze di significato in alcune triplette e ogni aminoacido ha un
solo tRNA mitocondriale specifico, diversamente da come avviene
nel nucleo.
Bisogna notare che sia la replicazione, che la trascrizione, che
la traduzione richiedono molteplici fattori, che sono codificati dal
nDNA, segno della dipendenza del genoma mitocondriale da quello
nucleare (Virbasius e Scarpulla, 1993). Più in generale numerosi
dati (Garesse e Vallejo, 2000) testimoniano la presenza di una
comunicazione tra il nucleo per il mitocondrio (diretta) e viceversa
(inversa) (Fig. 1.1.2).
Si sa ancora poco sui meccanismi di regolazione
dell’espressione genetica mitocondriale. Si conoscono alcuni
meccanismi di controllo della trascrizione: H1 e H2 come visto
prima; la sintesi dei prodotti delle due unità di trascrizione in
mitocondri isolati mostra una differente sensibilità a composti
chimici, bassa temperatura e ioni Ca
2+
e Mg
2+
e differenti richieste
di ATP (quindi meccanismi di regolazione indipendenti nei due tipi
di trascritti) (Gaines et al, 1987).
L’espressione dei geni per gli rRNA e degli adiacenti geni per
i tRNA è regolata a livello della terminazione della trascrizione
all’estremità 3’ del gene per l’RNA 16S, tramite un fattore proteico
Cap. 1 – Introduzione
- 7 -
chiamato mTERF (fattore mitocondriale di terminazione della
trascrizione). E’ da notare che il sito di legame per mTERF è
compreso entro il gene per il tRNA.
Sono sicuramente presenti, sebbene ancora non chiariti, dei
meccanismi di regolazione post-trascrizionali, che agiscono sulla
stabilità dei trascritti. I tRNA Phe e Val, contenuti nell’unità di
trascrizione dell’rRNA, sono trascritti 25 volte di più rispetto agli
altri geni, ma sono presenti in concentrazione solamente doppia
rispetto agli altri.
Fig. 1.1.2 : La comunicazione nucleo – mitocondrio. Rappresentazione schematica
della comunicazione diretta e inversa. Numerosi fattori intracellulari ed extracellulari sono trasmessi
direttamente al nucleo e/o al mitocondrio. Una eccezione è rappresentata dall’ormone della tiroide (T3), il
quale interagisce con recettori mitocondriali (P43) e nucleari (T3R), stimolando la trascrizione nel
mitocondrio direttamente e indirettmante (mediante sintesi di NRF (Nuclear Respiratory Factor) 1 e 2)
(Garesse e Vallejo, 2000).
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