Sviluppo di un nuovo anticorpo monoclonale diretto verso l’antigene mesotelina per applicazioni nella terapia e nella diagnosi oncologica

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ABSTRACT 
 
La mesotelina è una glicoproteina espressa in condizioni fisiologiche a livello delle cellule 
mesoteliali delle sierose dell’organismo (pleura, pericardio e peritoneo). La proteina è, 
invece,  overespressa sulla superficie cellulare di diversi istotipi tumorali tra cui: il 
mesotelioma maligno, il carcinoma ovarico, pancreatico e polmonare. La funzione 
fisiologica della mesotelina è sconosciuta, ma recentemente è stata ipotizzata una sua 
funzione nei meccanismi di adesione cellulare attraverso il legame a CA125. 
La limitata espressione della mesotelina a livello dei tessuti fisiologici e di contro, l’elevata 
espressione in molti tumori rendono la mesotelina un possibile target per la terapia anti-
tumorale. 
In questo progetto di tesi viene descritta la generazione e la caratterizzazione un 
anticorpo monoclonale specifico per la mesotelina. Tale mAb specifico per la mesotelina è 
stato prodotto mediante la tecnologia degli ibridomi e poi testato in analisi al FACS per 
valutarne la specificità e l’affinità di legame per l’antigene di interesse. Il mAb è risultato 
legarsi specificatamente a cellule mesotelina-positive, che esprimono l’Ag 
costitutivamente (OVCAR-3) e per trasfezione ((HEK293-mesotelina). Dagli studi di binding 
il nostro Ab è risultato avere un’affinità migliore dell’anticorpo monoclonale K1. 
I mAbs da noi prodotti potrebbero essere utili sia nella diagnostica per immagini che nella 
immunoterapia passiva in neoplasie che overesprimono la mesotelina.
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INTRODUZIONE  
 
Anticorpi monoclonali nella terapia anti-tumorale 
Il cancro e le malattie cardiovascolari rappresentano le prime cause di morte nei paesi 
industrializzati; se queste ultime possono beneficiare di terapie chirurgiche e 
farmacologiche sempre più efficaci, i tumori, soprattutto alcune neoplasie, continuano a 
essere patologie con poche alternative terapeutiche. Nella maggior parte dei casi la 
chirurgia rappresenta lo strumento più efficace per eliminare le masse tumorali, mentre 
la chemioterapia e la radioterapia sono utili come adiuvanti alla terapia chirurgica o sono 
la scelta terapeutica d’elezione nel trattamento delle forme metastatiche. La chemio e la 
radioterapia, agendo su tutte le cellule in attiva proliferazione, mancano di una reale 
specificità d’azione causando notevoli effetti collaterali. Le terapie più innovative puntano 
invece a sfruttare il sistema immunitario umano come meccanismo effettore, poiché i 
tumori derivano da cellule self che subiscono trasformazione neoplastica, è difficilmente 
evidenziabile, nei pazienti, una risposta immunitaria efficace nel controllare la patologia.  
Ciò è ascrivibile sia all’origine self delle cellule neoplastiche, sia, inoltre, a meccanismi di 
down-modulazione della risposta immunitaria, attivati dalla neoplasia stessa. I 
meccanismi effettori del sistema immunitario sono quindi potenzialmente in grado di 
distruggere in maniera selettiva le cellule tumorali (lisi Ab-mediata, attivazione cellule T e 
NK) e queste funzionalità devono essere indirizzate attraverso protocolli di 
immunoterapia.  
Gli obiettivi dell’immunoterapia sono quelli di stimolare il sistema immunitario attraverso 
la liberazione di citochine, l’attivazione di linfociti T o attraverso la somministrazione di 
anticorpi diretti contro antigeni tumorali  (Scuhster M. et al., 2006). A causa della loro 
instabilità genetica, le cellule neoplastiche esprimono proteine alterate, dette antigeni 
associati al tumore che non sono espresse o lo sono in minima entità sulle cellule normali 
(Keog E. et al., 2001). Gli antigeni tumore-associati (TAAs) espongono nuovi epitopi che 
sono riconosciuti dal sistema immunitario; la risposta immunitaria verso tali epitopi però 
ha solo effetti marginali sul tumore (Maeker B. et al., 2005). Durante la progressione 
neoplastica, si è dimostrato che la risposta immunitaria citotossica è inibita e i linfociti T 
infiltranti il tumore e le cellule presentanti l’antigene  (APCs) spesso sembrano non essere
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efficaci (Radoja S. et al., 2000). Inoltre, si è osservato che le stesse cellule neoplastiche 
sono in grado di ridurre la risposta immunitaria favorendo la secrezione di fattori 
immunosoppressivi (Kiessling R et al., 1999). 
L’immunoterapia mira, quindi, a rinforzare la risposta del sistema immunitario verso il 
tumore. L’ immunoterapia può essere di tipo attivo o di tipo passivo: 
- l’obiettivo dell’immunoterapia attiva è di indurre una risposta immunitaria (preventiva o 
terapeutica) endogena e a lungo termine verso le cellule neoplastiche, (vaccinazione) 
(Keog E. et al, 2001; Rosenberg S.A. et al., 1997); 
- obiettivo dell’immunoterapia passiva  è di indurre l’eradicazione/stabilizzazione del 
tumore mediante somministrazione di effettori immunologici, quali Abs o linfociti T 
tumore-specifici (isolati dal paziente, espansi in vitro e poi reinoculati), o Abs coniugati a 
tossine o radionuclidi. 
A differenza dell’immunoterapia attiva, quella passiva manifesta un’attività terapeutica di 
breve durata e necessita, quindi, di ripetute somministrazioni (Bertolaccini L. et al., 2001). 
Gli anticorpi mediatori della risposta umorale, riconoscono le struttura antigeniche 
neutralizzandole o mediano importanti funzioni come la citotossicità cellulare anticorpo 
dipendente (ADCC) o la citotossicità complemento mediata (CDCD) (Schuster, M. et al., 
2005). Diversi autori  ( Mellstedt H., 2003;  Maloney DG, 2002) hanno messo in risalto il 
fatto che gli anticorpi più efficaci in clinica sono proprio quelli con la maggior capacità di 
sfruttare quest’ultimo meccanismo,  vantaggio dovuto all’azione rapida e diretta, che non 
necessita dell’attivazione di processi intracellulari (come l’apoptosi) o del richiamo di 
cellule effettrici nella sede in cui si è sviluppato il tumore (citotossicità cellulare).  
 
Anticorpi e loro bersaglio 
Gli anticorpi o immunoglobuline sono glicoproteine sieriche facenti parte delle γ-
globuline. Tutte le molecole anticorpali hanno caratteristiche strutturali simili,con ampia 
variabilità nelle regioni leganti l’antigene. Ogni anticorpo presenta una struttura regolare 
costituita da due catene pesanti (Heavy chain, H) identiche (50 KDa), glicosilate, e due 
catene leggere (Light chain, L)identiche (25 KDa), non glicosilate per un peso complessivo
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di 150 KDa. Le catene pesanti e leggere sono tenute insieme da legami idrogeno e ponti 
disolfuro e sono costituite da domini, ognuno dei quali è formato da 110 amminoacidi.  
I primi domini, all’N-terminale, di ogni catena L ed H costituiscono la porzione variabile (V) 
dell’anticorpo, in cui si trova il sito specifico di legame per l’antigene. All’interno di questo 
sito sono presenti tre regioni ipervariabili, dette regioni determinanti la 
complementarietà (CDR, complementarity determining regions), che presentano la 
massima variabilità della catena aminoacidica (Kim et al., 2005). 
Le molecole anticorpali vengono funzionalmente divise in tre 3 regioni: 2 regioni variabili 
identiche, ovvero frammenti di legame all’antigene costituiti dalle porzioni VLCL 
accoppiate a quelle VHCH1, ed un frammento costante (Fc), costituito dai domini CH
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-CH
3
 
o CH
2
-CH
3
-CH
4
 delle due catene H unite da ponti disolfuro, mediatore delle funzioni 
effettrici degli anticorpi. Sono infatti proprio i domini CH2 e CH3 che sono in grado di 
attivare, a seconda della classe anticorpale, la cascata del complemento e quindi la 
citotossicità complemento dipendente (CDC), la citotossicità cellulare anticorpo 
dipendente (ADCC), la fagocitosi, l’attivazione delle mast-cellule (Fig. 1) (Goldsby et al., 
1976). 
 
 
 
Figura 1: Principali meccanismi d’azione degli anticorpi antitumorali (Cheson BD et al., 
2008).
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Le immunoglobuline (Ig) di maggior interesse terapeutico sono le IgG per la molteplicità e 
l’eterogeneità delle loro funzioni immunologiche, per la loro stabilità in vivo. Le IgG hanno 
un’emivita sierica di circa 3 settimane, mentre per gli altri isotipi anticorpali è di poche 
ore. Ciò è dovuto al legame del frammento Fc, in  particolare l’interfaccia tra le regioni 
CH
2
 e CH
3, 
con il suo recettore FcRn presente sulle cellule endoteliali dei vasi sanguigni 
che proteggono le IgG dal catabolismo, sequestrandole e impedendone la degradazione. Il 
FcRn lega le IgG circolanti e i risultanti complessi vengono endocitati rimanendo 
comunque protetti dalla degradazione intracellulare. I complessi FcRn/IgG possono poi 
essere riportati verso la membrana cellulare e nuovamente rilasciati nell’ambiente 
esterno. Questo continuo ciclo di internalizzazione/rilascio prolunga l’emivita media delle 
IgG (Kim et al., 2005).  
 
Gli anticorpi monoclonali 
Negli anni ’80 il problema principale nella terapia anti-tumorale era la mancanza di 
strumenti terapeutici con elevata specificità d’azione verso le cellule tumorali. Nasceva da 
qui la necessità di produrre delle molecole che riconoscessero con elevata selettività le 
cellule neoplastiche. La scoperta  della tecnologia degli ibridomi, grazie a Kolher e 
Milstein,  permise di produrre gli anticorpi monoclonali (mAb), reagenti che potevano 
essere dei possibili candidati ad applicazioni terapeutiche poiché dotati di elevata 
specificità per i loro target (Oldham RK 1983).  
La produzione di anticorpi monoclonali avviene secondo tappe sequenziali, riportate in 
figura 2. La generazione di cellule secernenti anticorpi monoclonali convenzionali si basa 
sul modello murino e consente la produzione di cellule immortali (ibridomi) secernenti 
anticorpi con specificità predeterminata (Antczak, D.F., 1982).
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Figura 2:  Produzione di anticorpi monoclonali con tecnologia degli ibridomi 
 
Ma gli anticorpi mAb murini presentano notevoli limitazioni al loro impiego in clinica. 
Il problema principale è legato all’elevata immunogenicità dei mAb, che essendo proteine 
murine possono essere utilizzati solo per trattamenti di breve durata con un numero 
limitato di somministrazioni poiché si sviluppa una risposta HAMA (human anti-mouse 
antibody) (Dillman RO, 1990). Questa risposta immunologica non solo blocca l’azione 
terapeutica degli Ab murini, causandone una rapida rimozione dal torrente circolatorio, 
ma può generare effetti collaterali molto seri in un paziente già di per sé critico 
(ipersensibilità di tipo III, formazione di immunocomplessi con conseguenti danni renali). 
Altre limitazioni, all’impiego degli mAb in clinica sono, la possibile mancanza di una 
efficace funzione effettrice ed inoltre, una marcata riduzione dell’emivita rispetto agli Ab 
umani. 
Al fine di soddisfare le esigenze cliniche, la naturale evoluzione degli ibridomi murini 
sarebbe stato la produzione di ibridi somatici umani teoricamente ottenibili con il 
semplice trasferimento della tecnica da una specie all'altra (Van Meurs, G.J. et al, 1986; 
Liu, H. et al., 1993). Nella realtà il processo non è stato realizzabile per diverse ragioni tra 
le quali l'indisponibilità di linee di mieloma umano con caratteristiche idonee.