Studio della comunità microbica associata al coleottero giapponese Popillia japonica

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Riassunto 
 
Il coleottero giapponese Popillia japonica è una specie appartenente alla famiglia degli 
Scarabeidi. Nativo del Giappone, dove è tuttavia controllato dai predatori naturali, si è diffuso 
all’inizio del XX secolo negli USA e in Canada, mentre negli anni ’70 è stato avvistato nelle 
Isole Azzorre. In Italia è presente dal 2014 ed è inserito come specie da quarantena nella lista A2 
della European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Gli adulti sono 
estremamente polifagi e danneggiano le piante scheletrizzando il fogliame, cioè consumando il 
materiale fogliare tra le vene, ma sono anche capaci di nutrirsi dei frutti. Le larve vivono nel 
terreno e si nutrono delle radici delle specie vegetali. Gli insetti hanno stabilito con i 
microrganismi delle relazioni simbiotiche di varia natura, le quali influenzano vari aspetti della 
biologia e fisiologia dell’ospite stesso, come la nutrizione, la difesa nei confronti di stress o la 
riproduzione. I simbionti possono inoltre contribuire al potenziale invasivo di un insetto aiutando 
il loro ospite ad adattarsi alle mutevoli condizioni ambientali. Queste interazioni rappresentano 
un interessante argomento di studio, da un lato per approfondire le conoscenze di base sulla 
simbiosi, dall’altro nell’ottica di sviluppare dei metodi di biocontrollo nei confronti di insetti 
dannosi o vettori di malattie, sfruttando la risorsa microbica ad essi associata. 
Questo lavoro di tesi si colloca all’interno di un progetto più ampio, volto a caratterizzare la 
variazione della comunità microbica, in termini di struttura e composizione, associata a P. 
japonica, quando alimentato su piante differenti. Nello specifico, gli obiettivi del presente studio 
sono stati: i) misurare l’abbondanza delle comunità batterica e fungina associate all’intestino del 
coleottero giapponese e osservarne la variazione in base all’alimentazione su piante diverse 
(Rosa agrestis, Prunus spinosa, Corylus avellana, o considerando insetti raccolti in campo, 
indicati come Testimone) e all’anno di campionamento (2017, 2018, 2019); e ii) costituire una 
collezione di isolati batterici con la finalità di valutarne il coinvolgimento in attività degradative 
di flavonoidi e terpeni, tipicamente presenti nelle piante con funzione di difesa nei confronti di 
stress biotici e biotici. 
Inizialmente, mediante l’utilizzo della PCR quantitativa è stata misurata l’abbondanza della 
comunità batterica che si è attestata ad un valore medio di 1,55 × 10
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 copie del gene 16S rRNA 
per intestino, con valori più elevati per gli insetti alimentati su P. spinosa. L’abbondanza della 
comunità fungina era, invece, in media di 1,32 × 10
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 copie dello spaziatore genico ITS1 per 
intestino, con valori anche in questo caso più elevati in caso di esemplari nutriti su P. spinosa. 
Si sono riscontrate differenze significative per quanto riguarda l’abbondanza delle copie del gene 
16S rRNA e del frammento genico ITS1 a seconda della dieta e dell’anno di campionamento,
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suggerendo che questi fattori possano influenzare le dinamiche delle comunità microbiche 
associate all’intestino degli adulti. L’influenza della dieta o del momento di campionamento sulla 
variazione della composizione della comunità microbica associata agli insetti è stata 
frequentemente dimostrata, mentre un numero minore di studi è disponibile per quanto riguarda 
la variazione dell’abbondanza delle comunità microbiche. I dati inoltre suggerivano che 
l’alimentazione su P. spinosa poteva favorire, nell’intestino dell’insetto, l’instaurarsi di una 
comunità fungina più abbondante rispetto agli esemplari alimentati sulle altre piante o che una 
maggior quantità di funghi poteva essere presente sul materiale ingerito dal coleottero in 
riferimento a questa pianta. La seconda parte del lavoro ha riguardato la costituzione di una 
collezione di isolati batterici. Mediante l’utilizzo di specifici terreni sono stati ottenuti da 
campioni di intestino di P. japonica 152 isolati, i quali sono stati identificati tramite il 
sequenziamento del gene 16S rRNA. Il phylum Proteobacteria è risultato essere quello più 
abbondante nella collezione (con le classi Alpha-, Beta- e Gammaproteobacteria), seguito dal 
phylum Firmicutes e da due isolati appartenenti al phylum Actinobacteria. I generi rappresentati 
nella collezione sono comunemente associati agli intestini di insetti: nello specifico, 
rappresentanti delle classi Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, 
Bacilli e Actinobacteria sono stati individuati anche in una ricerca, precedentemente condotta, 
di caratterizzazione della comunità batterica associata a P. japonica. Data l’estrema polifagia 
dell’insetto e considerando che composti presenti nelle piante, come terpeni e flavonoidi, 
possono rappresentare una difesa per la pianta stessa, si è quindi deciso di focalizzare l’attenzione 
verso il potenziale contributo dei microrganismi nel ridurre l’attività antagonista di alcune delle 
molecole citate. Tra i 152 membri della collezione sono stati, quindi, scelti sulla base alla loro 
identificazione tassonomica 20 isolati, appartenenti a 18 specie diverse, e sono stati condotti 
saggi di crescita in presenza di un’unica fonte di carbonio, quale naringina, quercetina o 
limonene. I risultati sono stati diversi in base all’isolato considerato: in generale, il limonene o 
la quercetina non si sono dimostrati particolarmente in grado di sostenere la crescita batterica, 
mentre per alcuni isolati si è osservata una buona crescita su naringina. Futuri esperimenti 
saranno condotti per misurare mediante la tecnica high pressure liquid chromatography (HLPC) 
la capacità dei batteri considerati di degradare molecole come la naringina e la quercetina. In 
conclusione, questo studio ha permesso di aumentare le conoscenze relative alla comunità 
microbica associata a P. japonica. Future ricerche dovranno approfondire il ruolo dei 
microrganismi intestinali nella degradazione dei flavonoidi, con particolare attenzione nei 
confronti del contributo microbico alla fisiologia dell’ospite in esame.
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Introduzione 
 
1. Insetti e simbiosi 
 
Le associazioni simbiotiche sono ubiquitarie in natura e giocano un ruolo fondamentale per 
l’ecologia e l’evoluzione degli organismi. La simbiosi è definita come un’intima interazione 
permanente tra organismi diversi. Gli organismi coinvolti in una simbiosi vengono 
generalmente definiti simbionti, anche se spesso si attribuisce il termine ospite al simbionte di 
maggiori dimensioni, che fornisce risorse, e quello di simbionte all’organismo più piccolo che 
vive sopra o dentro l’ospite, che consuma tali risorse e che potrebbe fornire dei servizi 
all’ospite. Questa relazione non è sempre benefica per entrambi gli organismi coinvolti; uno 
dei due, infatti, può trarre beneficio dalla simbiosi a spese dell’altro. 
Le relazioni simbiotiche sono divisibili in tre categorie in base al fatto che il simbionte porti 
beneficio, nessun effetto o sia dannoso per l’ospite
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: MUTUALISMO. Entrambi gli organismi 
in simbiosi, detti mutualisti, beneficiano della relazione. Si distinguono casi di mutualismo 
obbligato, dove i due simbionti non possono vivere uno in assenza dell’altro, e casi di 
mutualismo facoltativo o protocooperazione, dove i mutualisti possono vivere separatamente 
ma vivono in simbiosi perché entrambi traggono dei benefici
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; PARASSITISMO. Uno dei due 
simbionti trae vantaggio a discapito dell’altro. Il parassita provoca un danno all’ospite 
sfruttandone le risorse e/o manipolando il traporto delle risorse dell’ospite stesso. Una 
particolare forma di parassitismo è quella dei parassitoidi. I parassitoidi introducono le proprie 
uova sopra o dentro altri animali, spesso altri insetti, nei quali le uova si schiudono portando 
l’ospite ad una morte “programmata”. A volte questi organismi parassitano organismi che a 
loro volta sono parassiti di altri organismi e in questo caso si parla di iperparassitismo. 
COMMENSALISMO. Uno dei due simbionti, detto commensale, beneficia dell’interazione, 
mentre il secondo, detto ospite, non ne viene influenzato. Rientrano in questa categoria anche 
l’inquilinismo e la foresia, dove un simbionte trae vantaggio o vivendo al riparo dell’altro, o 
per spostarsi, rispettivamente. 
Nel regno degli animali gli insetti sono la classe più diversa in numero di specie, la più diffusa 
per gli habitat ecologici colonizzati e la più abbondante come biomassa livello globale
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. La 
diversità e il successo evolutivo degli insetti dipende in parte dalle loro miriadi di relazioni 
benefiche con i microrganismi, che sono noti per sopperire a diete povere di nutrienti; aiutare
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la digestione di sostanze recalcitranti nel cibo; proteggere gli ospiti da predatori, parassiti e 
patogeni; contribuire alle comunicazioni intra- e interspecifiche; influenzare l’efficienza di 
trasmissione di vettori di malattie; e influenzare l’accoppiamento e il sistema riproduttivo
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. 
 
1.1 Simbiosi obbligate e facoltative 
I simbionti microbici sono categorizzati in base all’età evolutiva e al grado di codipendenza tra 
ospite e simbionte (Fig.1). Da un lato ci sono i simbionti “primari” o “obbligati” che vivono 
solo nei batteriomi (organi specializzati nella custodia delle associazioni simbiotiche) e sono 
necessari per l’ospite. Dall’ altro lato i simbionti “secondari” o “facoltativi” non risiedono 
generalmente nei batteriomi e possono colonizzare diversi sistemi o organi dell’ospite, come 
ghiandole salivari, intestino, gonadi, emolinfa ecc., e non sono indispensabili per la 
sopravvivenza dell’ospite. In un ospite di solito coesistono simbiosi multiple sia per gli 
endosimbionti primari sia per i secondari
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. 
 
Fig. 1: Esempi di simbiosi tra diversi ospiti e i loro simbionti primari o secondari
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Più volte è stato dimostrato che i simbionti primari discendono da associazioni antiche e 
specializzate: i loro alberi filogenetici sono congruenti con quello dei loro ospiti per lungo 
periodo evolutivo, comprendendo l’inizio della simbiosi fino oggi
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 (Fig. 2). Si stima da 30 a 
270 milioni di anni come età di associazione. Questa lunga dipendenza con l’ospite si è riflessa 
con massicce alterazioni del genoma dei simbionti primari. Un’importante variazione nei 
simbionti ereditati dalla madre è l'estensione del degrado e della riduzione del genoma. 
 
Fig. 2: Esempi di coevoluzione nei simbionti degli insetti
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Esempi di batteri con un genoma ridotto comprendono Buchnera aphidicola da afidi
8
; 
Candidatus Blochmannia da formiche
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; Wigglesworthia glossonidia da mosche tsetse
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; 
Candidatus Baumannia cicadelinicola da cicaline
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. Tutti sono appartenenti alla classe γ-
Proteobatteri filogeneticamente vicini a Escherichia coli e altre enterobatteriacee. Tuttavia, E. 
coli e altri batteri liberi, non simbionti, possiedono un genoma di cinque milioni di basi 
codificanti per 5000 geni, mentre il genoma dei simbionti primari è di meno di un milione di 
basi codificante per circa 500 geni, e alcuni sono anche più piccoli
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. Il genoma di questi