Studio dell'espressione dell'AQP4 nel Muscolo Scheletrico di Pazienti Affetti da Miopatie di Membrana, Metaboliche e Neurogene

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   Un ulteriore parametro di caratterizzazione è rappresentato 
dall’energia di attivazione (E
a
), espresso in Kcal/mole; valori superiori 
alle 10 kcal/mole implicano una semplice diffusione (Fettiplace, 
1980), mentre valori minori o uguali a 5 Kcal/mole indicano un 
trasporto mediato, nello specifico da canali. 
   Già a partire dagli anni ’80 era stata postulata l’esistenza di elementi 
proteici in grado di veicolare l’acqua, dato sostanziato da misurazioni 
sulla permeabilità osmotica di membrane di diversi tipi cellulari, in cui 
il rapporto P
d 
/P
f 
 risultava maggiore di 1 con E
a 
minore di 5 Kcal/mole 
(Verkman, 1992; Finkelstein, 1987; Dempster et al., 1992). Inoltre 
furono condotti numerosi esperimenti che portarono all’identificazione 
di agenti mercurialici come il cloruro di mercurio (HgCl
2
) in grado di 
legarsi ai gruppi –SH di cisteine presenti nell’ipotetico canale, 
inibendo il trasporto d’acqua (Meyer et al., 1987). 
   Solo quattro anni dopo venne identificata la prima acquaporina 
ovvero la CHIP28 o AQP1 (Preston e Agre, 1991), segnando l’inizio 
di un ardente fermento intellettuale intorno a  queste, ancor oggi vivo. 
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1.2 Caratterizzazione delle acquaporine 
 
   Le acquaporine sino ad ora identificate in mammifero ammontano a 
dodici (Lee, 1997 e Ishibashi, 1998), numerate da 0 a 11 in ordine di 
scoperta e risultano essere estremamente conservate a diversi livelli 
evolutivi, partendo dai procarioti sino agli eucarioti superiori. Questo 
dato è indice di una rilevante importanza funzionale del canale. 
   L’AQP0 (MIP 26) è stata scoperta grazie all’elevata omologia con la 
CHIP28; si localizza a livello del cristallino ed ha una minima 
permeabilità all’acqua. La sua funzione è attualmente ignota. 
   La prima acquaporina scoperta è stata la CHIP28 o AQP1 (Channel 
Forming Integral Protein) (Preston e Agre, 1991); essa ha un peso 
molecolare di 28 kDa e risulta essere espressa in diversi tipi cellulari 
tra cui eritrociti, nel tubulo prossimale, nel tratto discendente dell’ansa 
di Henle, negli alveoli polmonari, nel colon, cornea ed altri tessuti. 
Essa è presente in membrana sottoforma di omotetramero, in cui ogni 
unità monometrica risulta essere un canale funzionalmente 
indipendente e due delle quattro subunità presentano residui 
glicosidici. 
Da un punto di vista strutturale, l’AQP1 è costituita da sei domini 
transmembrana (Preston e coll., 1991) e da cinque anse di 
collegamento; le anse B ed E recano un caratteristico motivo 
tripeptidico o NPA (asparagina, prolina alanina), estremamente 
conservato fra le acquaporine (Agre e coll., 1989). Inoltre la cisteina in 
posizione 189 dell’ansa E è la responsabile della caratteristica 
sensibilità agli agenti mercurialici. 
L’organizzazione spaziale delle suddette strutture dell’AQP1 fu risolta 
nel “modello a clessidra” pensato da Jung e coll. (1994) secondo il 
quale le anse B ed E costituiscono singolarmente due empori che si 
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avvicendano nel bilayer lipidico antiparallelamente, generando un poro 
completo capace di accogliere le molecole d’acqua in movimento. Tale 
modello fu successivamente verificato tramite indagini di 
cristallografia a raggi X . 
   L’AQP2 (WCH-CD, Water Channel Collecting Duct) è espressa 
selettivamente nella membrana apicale delle cellule principali del dotto 
collettore (Fushimi e coll., 1993) e risulta essere implicata nel 
riassorbimento di acqua indotto da ormone antidiuretico (ADH). 
   L’esistenza dell’AQP3 è stata riportata contemporaneamente da tre 
gruppi di ricerca indipendenti (Ishibashi e coll., 1994; Ma e coll., 
1994; Eschevaria e coll., 1994); i suoi siti di localizzazione sono  
molto variegati. Come dimostrato da esperimenti di 
immunolocalizzazione essa è presente nelle cellule principali del dotto 
collettore, nella porzione basolaterale delle cellule della trachea, 
nell’epitelio congiuntivale dell’occhio (ove pare essere responsabile 
della secrezione della componente acquosa delle lacrime) e nella 
membrana basolaterale delle cellule epiteliali dei villi del colon distale 
(Frigeri et al., 1995), della pelle e della vescica urinaria. Essa, inoltre, 
è abilitata al trasporto di altre piccole molecole come glicerolo ed urea 
( Ishibashi e coll.; Eschevaria e coll., 1994). 
   L’AQP4, oggetto di studio della mia attività di ricerca, è stata 
inizialmente clonata da una genoteca di cDNA di polmone (Hasegawa 
e coll., 1994) e successivamente da una di cervello (Jung e coll., 1994).  
Ha un peso molecolare di 30 kDa e si presenta sotto due isoforme 
denominate: M1 ed M23; esse non mostrano differenze strutturali, 
nonostante la coda aggiuntiva di ventitre amminoacidi che reca la 
seconda isoforma. 
Presenta inoltre un’elevata omologia con la CHIP28 nonostante 
differisca da questa per la sua spiccata caratteristica di rimanere 
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insensibile agli agenti mercurialici, motivo per il quale è anche 
conosciuta  come MIWC (Mercurial Insensitive Water Channel) 
(Hasegawa e coll., 1994; Jung e coll., 1994). 
Si contrappone, pertanto, a tutte le altre acquaporine che presentano 
fenomeni inibitori derivanti da agenti mercurialici, come il cloruro di 
mercurio, capace di legarsi al residuo di zolfo della cisteina  C
189
, 
generando un ingombro sterico tale da bloccare il flusso d’acqua 
attraverso il poro (Meyer e coll., 1987). 
Osservazioni di microscopia elettronica hanno messo in risalto la 
particolare attitudine dell’AQP4 a formare degli aggregati in 
membrana denominati OAP’s (Orthogonal Array of Particles), in cui le 
due isoforme risultano essere compresenti, generando dei punti di 
ingresso massivo di acqua. Esperimenti successivi hanno inoltre 
dimostrato che la presenza dell’isofroma M1 negli OAP’s tenda a 
disgregarli, probabilmente a causa della coda aminoacidica aggiuntiva 
che funge da leva laterale e che  induce la capacità di interazione fra 
monomeri.  
Il fatto che gli OAP’s potessero  essere correlati a fenomeni di 
regolazione osmotica nacque da osservazioni  condotte su tessuti in cui 
l’equilibrio di fluidi ed elettroliti è cruciale. Infatti, trasfettando cellule 
CHO (Ovary Aster Cell) con cDNA codificante l’AQP4 (Yang e coll., 
1996), poteva essere indotta l’espressione di una proteina di 31 KDa, 
oltre che di strutture equivalenti agli OAP’s, che invece non erano 
presenti in cellule trasfettate con cDNA non-sense, utilizzate come 
controllo. 
   Per quanto riguarda la distribuzione dell’AQP4, essa si localizza in 
diversi distretti tissutali ma la sua espressione è rilevante in particolar 
modo nel sistema nervoso centrale. Studi di ibridazione in situ oltre 
che di immunoistochimica hanno evidenziato la sua presenza nelle 
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cellule ependimali dei ventricoli cerebrali, nel rivestimento del sistema 
acquiduttale del cervello (Jung et coll., 1994) e nei processi astrocitici 
che circondano i vasi sanguigni cerebrali (Frigeri e coll., 1995b). 
Com’è noto, tali regioni sono coinvolte nel riassorbimento del liquido 
cerebrospinale (Adams e coll., 1989; Lyons e coll., 1990) oltre che 
nella regolazione osmotica del distretto cerebrale, lasciando 
ovviamente presupporre un ruolo chiave del poro nella realizzazione di 
tali processi. 
Era già nota una marcata redistribuzione degli OAP’s negli astrociti di 
ratti epilettici (Hatton ed Ellisma, 1984) oltre che una diminuzione 
della loro densità a seguito di ischemia (Suzuki e coll., 1984). 
L’AQP4 è stata inoltre individuata nello strato del Purkinje del 
cervelletto e nei nuclei sovraottico e paraventricolare dell’ipotalamo 
(Jung e coll., 1994; Nielsen e coll., 1997) probabilmente implicata 
nell’osmoregolazione di quest’ultimo distretto. Per quanto riguarda il 
rene, l’AQP4 è stata individuata nella porzione basolaterale delle 
cellule principali del dotto collettore (Frigeri e coll., 1995a), laddove 
esiste una spiccata permeabilità all’acqua. Verosimilmente l’AQP4 
determina la fuoriuscita dell’acqua dalle medesime cellule, entrata 
attraverso l’AQP2 localizzata nella porzione apicale. A dimostrazione 
della veridicità di questo processo esistono esperimenti condotti su topi 
knock-out per l’AQP4 le cui urine risultano meno concentrate se 
paragonate a quelle dei relativi topi controllo (Chou e coll., 1998). 
Inoltre l’AQP4 insieme all’AQP2 e all’AQP3 risulta localizzata a 
livello delle cellule del dotto collettore (Echevaria e coll., 1994; Frigeri 
e coll., 1995a) lasciando postulare l’esistenza di un’attività incrociata e 
sinergica tra i tre diversi pori; è noto infatti che la porzione apicale dei 
tubuli sia impermeabile all’acqua. Inoltre è presente una distribuzione 
assiale di AQP3 ed AQP4 lungo il dotto collettore tale che la prima sia 
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più espressa nella regione corticale mentre la seconda in quella 
midollare, sebbene esista un ampio tratto in cui esse siano 
compresenti. 
Altri siti in cui è presente l’AQP4 sono le cellule epiteliali delle vie 
aeree (Folkelsson e coll., 1994; Frigeri e coll., 1995a), il colon e gli 
occhi, le ghiandole salivari e lacrimali e la membrana basolaterale 
delle cellule parietali della mucosa gastrica. 
E’ stata dimostrato, inoltre, che cellule gastriche in coltura 
precedentemente trasfettate con cDNA codificante AQP4 di ratto, se 
trattate con istamina per almeno 20 minuti, mostrano una riduzione di 
almeno il 50% di OAP’s nella porzione basolaterale della membrana  
riducendo altresì il P
f
 del 35%. Pare che la riduzione degli OAP’s sia 
dovuta all’internalizzazione dell’AQP4, indicando una down-
regolazione della stessa. 
L’ultimo sito di localizzazione dell’AQP4 è il muscolo scheletrico, di 
cui avrò modo di parlare in maniera esaustiva più avanti. 
   L’AQP5, identificata mediante clonaggio per omologia (Raina e 
coll., 1995) risulta essere espressa nelle ghiandole salivari e lacrimali, 
nella trachea oltre che nel polmone e risulta essere inibita da agenti 
mercuriali. 
   L’AQP6 è espressa selettivamente nel rene (Ma e coll., 1997), 
mentre l’AQP7 e l’AQP8 sono state isolate e clonate dal testicolo di 
ratto e sono espresse maggiormente nell’apparato genitale maschile. 
L’AQP8 è in aggiunta espressa nel pancrease nel fegato di ratto 
(koyama e coll., 1997). 
  L’AQP9, invece, è stata clonata dal tessuto adiposo umano 
(Kuriyama e coll., 1997) dal fegato di ratto (Hediger e coll., 1998) e 
dai leucociti umani; studi funzionali hanno messo in evidenza che tale 
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acquaporina possa trasportare anche altri soluti come purine, pirmidine 
e pioli oltre a glicerolo ed urea come l’AQP3 e l’AQP7. 
   L’AQP10, sebbene isolata da testicolo, è risultata essere un 
pseudogene. 
   La presenza dell’AQP11, infine, è stata riscontrata in numerosi 
tessuti di ratto tra cui rene, fegato, cervello e testicolo. Presenta una 
distribuzione unica nel cervello, essendo espressa a livello dei dendriti 
delle cellule del Purkinje, nei neuroni dell’ippocampo del CA1 e CA2, 
e nei neuroni cerebrali corticali. Esperimenti di immunofluorescenza 
condotti sulle cellule del Purkinje, mettono in evidenza una 
localizzazione intracellulare. Diversamente dalle altre acquaporine, gli 
oociti di Xenopus che esprimono l’AQP11 in membrana, non sono 
capaci di veicolare acqua, glicerolo, urea o ioni. (P.Agre e coll., 2006). 
La sua funzione rimane pertanto non ben definita a causa del suo 
comportamento anomalo rispetto a tutte le altre acquaporine. 
 
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Immagine 1.1  Localizzazione delle acquaporine nel corpo umano. 
 
Estratto da: http://www.ks.uiuc.edu/~emad/BIOPHYS490M/09-aquaporins1.pdf