Struttura secondaria e importanza filogenetica della subunità ribosomale mitocondriale 12S nei Collemboli (Insecta)

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per 14 specie di Collemboli, che rappresentano le famiglie Isotomidae, 
Entomobryidae, Actaletidae, Tomoceridae, Onychiuridae e Poduridae. 
I geni che codificano per gli rRNA, siano essi  mitocondriali o nucleari, 
sono stati intensamente studiati a causa del loro ruolo critico nell’assemblaggio 
delle proteine del complesso ribosomale (Brimacombe et al. 1983, Noller et al. 
1990). Gli rRNA nucleari sono presenti in numerose copie in vertebrati e 
invertebrati, mentre quelli mitocondriali sono disponibili in grande quantità, 
perché fanno parte del genoma di questi organelli. Tutti gli RNA ribosomali 
possiedono motivi di sequenza conservati e formano strutture secondarie stabili. 
Queste caratteristiche strutturali li hanno resi "adatti" per analisi filogenetiche tra 
organismi di diverso livello tassonomico. 
Introdurre un approccio di tipo molecolare al problema della filogenesi dei 
collemboli appare di una certa utilità. Difatti, il confronto delle sequenze ottenute 
per le specie analizzate, ci ha fornito risultati capaci di confermare le ipotesi 
tradizionali, basate su indizi morfologici, e, in alcuni casi, di aggiungere nuove 
ipotesi, laddove quelle tradizionali apparivano controverse o poco chiare. 
Uno degli aspetti che abbiamo trattato con particolare attenzione in questa 
tesi riguarda l’approfondimento dei caratteri strutturali e molecolari dei geni 
ribosomali mitocondriali. Estremamente interessante ci è sembrata l’analisi delle 
strutture secondarie, l’osservazione delle porzioni altamente conservate della 
molecola e la composizione a livello di basi nucleotidiche delle sequenze 
complete e di stems e loops. 
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CAPITOLO 1 
ORDINE COLLEMBOLA (Lubbock; 1870) 
 
 
L’Ordine Collembola include piccoli artropodi (fino a pochi mm di 
lunghezza), edafici e primitivamente atteri. Il nome scientifico deriva dal Greco 
classico colle (=incollare) ed embolon (=pistone) e fa riferimento a una delle 
caratteristiche distintive del gruppo, cioè la presenza del tubo ventrale. 
Classificazione e identificazione dei Collemboli sono basate prevalentemente su 
caratteri morfologici quali chetotassi (la distribuzione delle setole sulla superficie 
del corpo), modelli di pigmentazione e struttura dell’apparato boccale. Tuttavia 
Cassagnau (1971) e Bretfeld (1986) hanno utilizzato anche la citologia e il 
comportamento per studi ad alto livello tassonomico. 
Tradizionalmente i collemboli sono raggruppati nei tre sottordini degli 
Arthropleona, comprendenti le superfamiglie Poduroidea (sei famiglie) ed 
Entomobryoidea (nove famiglie), dei Symphypleona (due famiglie) e dei 
Neelipleona (una famiglia) (Massoud 1976). Agli Arthropleona appartengono le 
specie con corpo allungato e con tergiti ben separati tra loro. I Symphypleona e i 
Neelipleona hanno un corpo di forma globulare e questa caratteristica è dovuta 
alla fusione di diversi segmenti sia toracici che addominali. Il corpo è organizzato 
in un capo distinto con un paio di antenne segmentate, un torace con tre segmenti 
portanti zampe e un addome con sei segmenti. Il capo è generalmente prognato, 
ma nei sottordini Symphypleona e Neelipleona è di tipo ipognato o "obliquamente 
ipognato", cioè l’asse lungo del capo è verticale rispetto a quello del corpo 
(Salmon 1964). Le antenne sono costituite da quattro articoli dotati ciascuno di 
muscolatura propria e sono particolarmente ricche di strutture sensoriali; esse 
infatti, portano sete ordinarie e sete sensoriali. Tutti i collemboli, a livello del 
terzo antennomero, presentano un organo sensoriale, costituito da due o più 
sensilli protetti da sete ordinarie. In alcune specie uno o più antennomeri sono 
suddivisi in subunità, così da rendere le antenne molto flessibili. Esse sono 
estremamente sviluppate nelle specie troglofile cieche, in quanto il ridotto 
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irraggiamento delle caverne ha determinato una riduzione delle strutture sensoriali 
fotorecettive. Le antenne possono essere estremamente lunghe in specie che 
vivono sul terreno o tra le foglie; infatti in alcune specie di Entomobryidae la 
lunghezza delle antenne supera quella totale del corpo. Nei Tomoceridae il terzo 
segmento antennale è molto più lungo del quarto: questa caratteristica permette 
loro di ripiegare le antenne a spirale. Inoltre, negli Sminthurididae le antenne sono 
modificate a livello del II e III antennomero a formare una struttura a pinza 
utilizzata dal maschio, durante l'accoppiamento, per afferrare le antenne della 
femmina e guidarla alla raccolta della spermatofora (Massoud e Betsch 1966). 
I collemboli sono insetti entognati, hanno cioè mandibole e mascelle 
"nascoste" all’interno della cavità boccale, formata da pliche della cuticola 
craniale fuse con il labium. Gli occhi, caratteristicamente più primitivi degli 
"occhi composti" degli insetti pterigoti, sono costituiti da placche oculari formate 
da un massimo di otto ocelli su ciascun lato del capo. Le specie che vivono negli 
strati meno superficiali del suolo e in caverne presentano una riduzione del 
numero di ocelli e spesso sono completamente cieche. Tra la base di inserzione 
delle antenne e la piastra oculare è presente l'organo postantennale (PAO) che può 
essere assente in alcune famiglie, (come negli Entomobryidae, Sminthuridae e 
nella sottofamiglia Neanurinae) e, quando presente, assumere forma variabile a 
seconda delle specie. Esso ha l’aspetto di una protuberanza a quattro lobi in 
Hypogastrura socialis o a 6-9 lobi in Anurida maritima, di rosetta allungata negli 
Onychiuridae, mentre negli Isotomidae appare come una piastra cuticolare ovale o 
a forma di "corno". La struttura del PAO ha avuto grande importanza 
tassonomica, particolarmente negli Onychiuridae, nonostante la sua funzione non 
sia stata ancora del tutto compresa. Studi di microscopia indicano che potrebbe 
svolgere una funzione chemiosensoriale che consente all'insetto di avvertire 
l'odore e l'umidità (Dallai 1971; Altner e Thies 1984). 
Nel sottordine Arthropleona i segmenti toracici sono generalmente ben 
identificabili e di uguali dimensioni, mentre nei Symphypleona e Neelipleona la 
loro fusione ne rende difficile l’identificazione. Le zampe sono composte da 
cinque articoli: precoxa, coxa, trocantere, femore e tibiotarso; all’estremità del 
tibiotarso è presente un piccolo pretarso armato di unghia e di appendice 
empodiale o unguicolo. Il primo segmento addominale porta ventralmente 
un’appendice cilindrica, il tubo ventrale o colloforo. Il tubo ventrale presenta 
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apicalmente un paio di vescicole che possono essere estroflesse così da permettere 
anche l'adesione su superfici lisce. La funzione di questo organo non è stata 
completamente chiarita. Si pensa che esso regoli in qualche modo il bilancio 
idrosalino consentendo lo scambio di soluti attraverso la cuticola dell'insetto. In 
posizione distale rispetto al tubo ventrale è presente la furca, un organo saltatorio 
che rappresenta una delle caratteristiche distintive del gruppo. La furca si origina 
ventralmente dal quarto segmento addominale ed è composta da una porzione 
impari, il manubrio, dal quale si dipartono due prolungamenti, i denti, alla cui 
estremità si trova il mucrone. In posizione di riposo, la furca è ripiegata sotto la 
superficie ventrale, e qui trattenuta dal retinacolo, un’appendice ventrale del terzo 
segmento addominale. La furca è particolarmente sviluppata nelle specie epigee, 
mentre è ridotta o assente nelle specie ipogee. Generalmente le specie in cui la 
furca è ben sviluppata, tendono a fare singoli, ma lunghi balzi per sfuggire ai 
predatori, mentre quelle in cui la furca è ridotta fanno salti brevi e frequenti per 
coprire la stessa distanza (Bauer e Christian 1987). 
I collemboli sono ubiquitari; essi hanno occupato gli ambienti più disparati, 
quali la lettiera del sottobosco, le rive di fiumi, le coste marine rocciose e gli 
habitats "estremi" come il Continente Antartico. In ogni caso la loro distribuzione 
è condizionata dall'umidità. Infatti, questi sono dotati di una cuticola poco 
sclerificata in confronto agli altri insetti, che non offre un'adeguata opposizione 
alla perdita d'acqua. 
Il corpo presenta una chetotassi più o meno accentuata; infatti, si possono 
distinguere sete ordinarie, sensilli, scaglie, tricobotri ecc. Negli Entomobryidae, è 
caratteristica la presenza di squame di colore metallico che ricoprono il corpo e 
sembrano proteggere l'individuo dall’evaporazione. Caratteristici sono anche gli 
“pseudocelli” degli Onychiuridae che, contrariamente a quello che potrebbe far 
pensare il loro nome, non hanno niente a che fare con la visione, dal momento che 
gli Onychiuridae sono ciechi. Gli "pseudocelli" si presentano come strutture 
circolari distribuite su testa, torace, addome e appendici. Quando gli individui 
vengono disturbati, essi rilasciano fluidi di difesa prodotti da particolari ghiandole 
annesse agli “pseudocelli”. 
I collemboli presentano grande variabilità anche riguardo alla 
pigmentazione; sono note specie depigmentate, ma anche specie che mostrano 
colorazioni scure o molto vivaci. I Poduroidea comprendono quelle famiglie in cui 
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i segmenti del protorace sono ben sviluppati e portano sempre delle sete dorsali; 
in genere si fa un grande uso della struttura delle parti boccali per separare le varie 
famiglie. Le specie sono relativamente poco mobili e la maggior parte di esse vive 
sul suolo, sotto le pietre, le cortecce degli alberi e le foglie secche. Alcuni hanno 
perso la capacità di saltare. Agli Entomobryoidea appartengono le specie più 
attive e contraddistinte da una grande abilità nel salto. Queste hanno il protorace 
fortemente ridotto e privo di sete dorsali. I Symphypleona presentano sempre la 
furca, mentre negli Arthropleona questa struttura è talvolta persa secondariamente 
(Neanuridae ed Onychiuridae); alcuni Symphypleona, sono caratterizzati dalla 
presenza di un sistema tracheale più o meno sviluppato, mentre negli altri gruppi 
la diffusione dei gas respiratori avviene attraverso la sottile cuticola. Infine i 
Neelipleona comprendono la singola famiglia Neelidae a cui appartengono 
organismi piccoli, ciechi che vivono sul suolo. I collemboli si alimentano di 
materia organica in decomposizione, quali ife fungine, frammenti di xilema e 
polline e sembrano occupare una posizione importante nel riciclaggio della 
materia organica (Lupetti et al. 1989). In generale l’apparato boccale è di tipo 
masticatore, ma diversi generi, particolarmente in Neanuridae, succhiano i liquidi 
organici e, pertanto, presentano mascelle e mandibole modificate a formare un 
apparato boccale succhiatore. 
 
Background morfologico 
 
La classificazione e le relazioni filogenetiche all’interno dell’ordine 
Collembola sono ancora molto controverse. Alcuni aspetti dibattuti della 
filogenesi del gruppo si riflettono nella diversa determinazione del numero di 
sottordini e di famiglie da parte dei vari autori. Tutte le ipotesi di relazioni 
filogenetiche tra sottordini e famiglie hanno utilizzato prevalentemente caratteri 
morfologici. Paclt (1956) e Salmon (1964) hanno basato le loro stime 
sull'orientamento del capo in rapporto ai segmenti postcefalici (capo prognato e 
ipognato), sul tipo di segmentazione dell'addome e sull'evoluzione dell'apparato 
boccale. Yosii (1961) ha raggruppato i diversi organismi in accordo con la 
distribuzione delle setole sulla superficie del corpo. Uchida (1971) ha preso in 
considerazione, oltre ai caratteri morfologici classici, il numero dei cromosomi e 
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la preferenza dell'habitat di ciascun gruppo. La filogenesi proposta da Cassagnau 
(1971) è risultata dalla sintesi di informazioni sull'ecologia, sulla morfologia 
esterna e sull'organizzazione morfologica del sistema neurosecretore 
retrocerebrale. L'albero proposto da Massoud (1976) differisce da quello 
pubblicato da Cassagnau (1971) solo nel riconoscere i Neelidae come una linea 
indipendente rispetto ai Symphypleona elevandola al rango di ordine. 
Nonostante i numerosi punti di dissenso, tutte le ipotesi morfologiche 
proposte concordano nel riconoscere le seguenti linee evolutive: 
™ la superfamiglia Poduroidea (sottordine Arthropleona), comprendente le 
famiglie Hypogastruridae, Onychiuridae e Neanuridae; alcuni autori 
attribuiscono a questa superfamiglia anche la fam. Poduridae (contenente 
l'unica specie Podura aquatica), la cui posizione è peraltro controversa. 
™ la superfamiglia Entomobryoidea (sottordine Arthropleona), comprendente le 
famiglie Isotomidae, Tomoceridae ed Entomobryidae. 
™ il sottordine dei "Symphypleona", comprende organismi dall'aspetto 
globulare; dove la maggior parte del corpo è costituita dall'addome (es: 
Sminthuridae), mentre in altri è formata dal torace (Neelidae). 
L'ipotesi filogenetica più condivisa, almeno a livello di famiglie, è quella 
proposta da Cassagnau (1971) e Massoud (1976), modificata da Bretfeld (1986) 
per i Symphypleona. (Fig.1) 
Altrettanto controversa appare la filogenesi all'interno del sottordine 
Arthropleona, tradizionalmente suddiviso nelle due superfamiglie Poduroidea ed 
Entomobryoidea (Börner 1901). Per esempio, nelle ipotesi proposte da Paclt 
(1956), Cassagnau (1971) e Massoud (1976), la famiglia Tomoceridae ha stretti 
legami di parentela con la famiglia Entomobryidae mentre Salmon (1964) e 
Uchida (1971) la vedono strettamente correlata alla famiglia Isotomidae; 
viceversa, nell'ipotesi proposta da Christiansen e Bellinger (1980), i Tomoceridae 
vengono considerati come una sottofamiglia della famiglia Entomobryidae. 
Opinioni discordanti riguardano la monofilia della superfamiglia Poduroidea e la 
reale posizione delle famiglia Poduridae. A tale proposito tecniche di microscopia 
elettronica hanno introdotto caratteri diagnostici innovativi (Dallai e Malatesta 
1973): l'esame della struttura cuticolare descritta in Podura aquatica, unico 
rappresentante della famiglia Poduridae, è in accordo con quei dati che la 
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collocavano su di un ramo evolutivo staccatosi precocemente dai Poduroidea e 
affine alla famiglia Hypogastruridae (Cassagnau 1971).