Sintesi di analoghi del paclitaxel e del docetaxel a conformazione vincolata

 2
subunità β  dell’eterodimero della tubulina, la proteina che costituisce i 
microtubuli del fuso mitotico, accelerando la polimerizzazione della 
tubulina ed allo stesso tempo stabilizzando i microtubuli formatisi, 
inibendone la depolimerizzazione (fig. 2). 
 
 
Figura 2:schema del meccanismo d’azione del paclitaxel. 
 
L’inibizione della depolimerizzazione dei microtubuli tra la profase e 
l’anafase della mitosi porta all’arresto del ciclo di divisione cellulare, con 
la conseguente morte delle cellule cancerose. 
Il primo problema che si è dovuto affrontare, di seguito all’estrazione 
del paclitaxel dalla corteccia del tasso, è stato quello 
dell’approvvigionamento del principio attivo, in quanto l’estrazione 
avrebbe comportato alti costi e basse rese, oltre alla rapida estinzione della 
specie. Tale ostacolo è stato superato con la scoperta della 10-
deacetilbaccatina III 3 (DAB, fig. 3), un diterpenoide che include il 
complesso sistema tetraciclico del paclitaxel e che viene isolato con buone 
rese da diverse parti della pianta del tasso europeo (Taxus baccata), 
 3
soprattutto dalle foglie (1 g di DAB per 1 Kg di foglie fresche), che ne 
costituiscono una fonte più facilmente rinnovabile.
5
 
 
HO
OH
O
HO
H
O
O
O
O
O
OH
OH
NH
H
OO
43
HO
1
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10 9
8
7
6
5
4
3
2
3'
2'
1'
 
Figura 3 
 
La semisintesi del paclitaxel, partendo dal composto 3, richiede la 
sintesi asimmetrica del residuo N-benzoil-3-fenilisoserinico 4 con 
configurazione (2’R, 3’S) (fig. 3),
6
 seguita dalla condensazione di tale 
residuo amminoacidico con l’ossidrile in 13 della DAB.
5-9 
In questo modo 
la semisintesi del paclitaxel a partire dal composto 3 consente un migliore 
approvvigionamento del farmaco, oltre a favorire lo sviluppo di nuovi 
tassoidi con migliori proprietà farmacologiche, come lo stesso docetaxel, 
che presenta più elevata citotossicità del paclitaxel verso alcune linee 
tumorali.
10
 
 
 4
2. Studi sulle conformazioni biologicamente attive del paclitaxel e 
docetaxel  in soluzione  
 
 L’elemento chiave dell’attività antimitotica del paclitaxel è stato 
individuato, attraverso studi di relazione struttura-attività (SAR),
11,12
 nella 
catena laterale fenilisoserinica al C13, oltre che nell’anello ossetanico e nel 
benzoato in C2, rivelandosi essenziale, in questi termini, anche una precisa 
stereochimica ai carboni C2’ e C3’.
13
 Non è ancora noto, invece, quali 
siano le conformazioni biologicamente attive adottate dalla molecola, per 
cui le attuali ricerche sui tassoidi si sono concentrate sullo studio di queste 
ultime, in particolare delle conformazioni per prime riconosciute dal sito di 
binding sulla β -tubulina (conformazioni di riconoscimento), e di quelle 
assunte in seguito al legame col microtubulo nel complesso paclitaxel-
tubulina (conformazioni legate). E’ evidente, infatti, che una migliore 
valutazione della precisa geometria delle conformazioni assunte dal 
paclitaxel in ambiente polare, quale è quello del citosol, e dei fattori che 
influenzano il comportamento conformazionale della catena laterale 
amminoacidica ha grande rilevanza per lo studio di come la tubulina 
discrimina tra le varie conformazioni della molecola; d’altro canto gli studi 
SAR,
11,12
 e recenti studi cristallografici sulla tubulina condotti da 
Nogales,
14
 hanno definito il sito di binding sui microtubuli come una tasca 
idrofobica. Ciò ha conferito notevole importanza agli studi conformazionali 
anche in ambiente apolare, che hanno come scopo principale la 
determinazione della conformazione del paclitaxel legato alla tubulina, 
onde ottenere informazioni più dettagliate sulla struttura del sito di binding. 
Quindi le analisi conformazionali in solventi polari hanno l’obiettivo di 
determinare quelle conformazioni riconosciute dalla tubulina, mentre quelli 
 5
effettuati in ambiente apolare guardano verso l’identificazione della 
conformazione del paclitaxel legato al microtubulo.  
Le strutture tridimensionali del paclitaxel sono state investigate 
attraverso analisi di spettroscopia NMR in congiunzione con studi di 
modellistica molecolare,
15-22  
ed analisi cristallografiche ai raggi X,
23
 
evidenziando l’elevata flessibilità del residuo amminoacidico e la relativa 
rigidità del sistema diterpenico. Ciò ha contribuito a concentrare 
l’attenzione di diversi gruppi di ricerca sullo studio del comportamento 
conformazionale in soluzione della catena laterale del paclitaxel lungo il 
legame C2’-C3’. I risultati di tali ricerche hanno mostrato che la rotazione 
attorno ai legami singoli della catena laterale è limitata, e che le 
conformazioni di quest’ultima sono determinate non solo da fattori 
puramente sterici, ma anche dalla tendenza a formare una rete di interazioni 
di legame idrogeno intramolecolari tra i gruppi funzionali. In particolare gli 
studi condotti sulla molecola del paclitaxel in solventi apolari, come CDCl
3
 
e CD
2
Cl
2
, hanno evidenziato un sistema di legami idrogeno tra l’ossigeno 
del carbonile in C1’, l’ossidrile in C2’ ed il gruppo ammidico in C3’. Nel 
paclitaxel, inoltre, data la presenza di gruppi esterei lipofilici sulla catena 
laterale e sul sistema diterpenico, giocano un ruolo determinante anche le 
interazioni idrofobiche descritte da Vander Velde;
18
 infatti, attraverso una 
combinazione di studi NMR e di modellistica molecolare sul paclitaxel in 
soluzione di DMSO-d
6
/D
2
O,
15
 è stato visto che in solventi più polari la 
conformazione della catena laterale viene alterata. L’interazione chiave, in 
queste conformazioni assunte dal paclitaxel in ambiente acquoso, è il 
cluster idrofobico tra il fenile del benzoato in C2, il metile dell’acetato in 
C4, ed il fenile in C3’, mentre il fenile del gruppo benzammidico della 
catena laterale non sembra essere coinvolto in questo tipo di interazioni.
18 
 6
In base a questi studi, fondati su dati NMR e di modellistica 
molecolare, sono stati proposti tre domini conformazionali per la catena 
laterale amminoacidica del paclitaxel: la conformazione A, tipica in 
solventi apolari,
24 
e le conformazioni B e C, rilevanti in solventi polari (fig. 
4).
15,17,18,20
 
 
NHCOC
6
H
5
C
6
H
5
H
H
COOHO
A
H
C
6
H
5
OCHN C
6
H
5
H
COOHO
B
H
COO
HO
C
6
H
5
H
C
6
H
5
OCHN
C
 
Figura 4: proiezioni di Newman delle conformazioni assunte dalla catena 
laterale del paclitaxel lungo il legame C2’-C3’ (A in CDCl
3 
e CD
2
Cl
2
; B e C 
in DMSO-d
6
/D
2
O). 
 
La conformazione A,
15,17 
caratterizzata da una disposizione sfalsata 
gauche con un angolo diedro H2’-C2’-C3’-H3’ di circa 60°, è la 
conformazione più comunemente osservata in solventi organici apolari 
aprotici, come CDCl
3
 e CD
2
Cl
2
.
 
Questa conformazione è stata proposta 
come quella probabilmente assunta dalla catena laterale del paclitaxel in 
seguito al binding con la tubulina, sulla base della predetta idrofobicità del 
sito di legame.
 
La conformazione B,
15,17
 che possiede una disposizione 
sfalsata anti al legame C2’-C3’ con un angolo diedro H2’-C2’-C3’-H3’ di 
circa 180°, presente in ambiente acquoso, è stata proposta da Vander Velde 
come la “conformazione di collasso idrofobico”.
18 
La conformazione C,
20 
dotata di un arrangiamento quasi eclissato al legame C2’-C3’ con un 
angolo diedro H2’-C2’-C3’-H3’ di circa 120°, è stata identificata da Ojima 
sulla base di studi svolti su analoghi fluorurati di paclitaxel e docetaxel, 
utilizzando tecniche 
19
F-NMR in solventi polari.
 
Questa è, secondo Ojima, 
 7
la conformazione prevalente in solventi polari protici a temperatura 
ambiente, in equilibrio conformazionale con la struttura B.
20 
Basandosi su 
questi dati sperimentali, Ojima ipotizza che questa terza conformazione in 
soluzione potrebbe essere la struttura molecolare per prima riconosciuta dal 
sito di binding sulla β -tubulina nei microtubuli.
20
  
Recenti ricerche, condotte da Viterbo e dai suoi collaboratori sulla 
sola catena amminoacidica attraverso calcoli ab initio e semiempirici,
25
 
hanno messo in evidenza due possibili conformazioni della catena laterale, 
denominate ch 1 e ch 5’, rispettivamente prevalenti in ambiente apolare ed 
in ambiente polare. La conformazione ch 1, quella nettamente 
predominante in ambiente apolare, è caratterizzata da una forma ad L e da 
un angolo diedro H2’-C2’-C3’-H3’ calcolato di 52°,
25
 paragonabile a 
quello posseduto dalla conformazione A, anch’essa prevalente in solventi 
apolari, confermando tali calcoli. Sulla base della già descritta idrofobicità 
del sito di binding sui microtubuli, Viterbo ed i suoi collaboratori hanno 
ipotizzato che, nella molecola di paclitaxel legata al recettore sulla 
tubulina, la catena laterale amminoacidica al C13 viene a trovarsi in una 
conformazione molto simile alla ch 1,
25
 cioè quella favorita in ambiente 
apolare.
 
D’altra parte Ojima, attraverso lo studio di analoghi fluorurati del 
paclitaxel legati alla β -tubulina con tecniche spettroscopiche 
19
F-NMR e 
studi di modellistica molecolare,
26
 ha ipotizzato che la conformazione della 
molecola legata al microtubulo possiede un angolo diedro H2’-C2’-C3’-
H3’ di 180°, molto simile alla conformazione B.
 
In definitiva vi sono due ipotesi contrastanti relativamente alla 
conformazione del paclitaxel legato alla tubulina: quella di Viterbo e dei 
suoi collaboratori,
25
 che la assimilano alla conformazione A, assunta in 
ambiente idrofobico,
 
e quella di Ojima,
26 
che la mette in relazione con la 
 8
conformazione B del paclitaxel, presente in ambiente polare.
 
E’ importante 
ricordare che tali ipotesi non sono frutto di esperimenti eseguiti 
direttamente sul paclitaxel. L’ipotesi di Ojima si basa infatti su studi 
eseguiti su analoghi fluorurati, mentre l’ipotesi di Viterbo  deriva da calcoli 
eseguiti sulla sola catena laterale. Inoltre, recentissime ricerche condotte su 
quattro tipi differenti di sostanze naturali ad attività antimitotica, il 
paclitaxel, gli epotiloni A e B, la eleuterobina e la discodermolide, 
accomunati dallo stesso meccanismo d’azione, hanno portato diversi 
ricercatori ad ipotizzare un farmacoforo ed un sito di binding sulla tubulina 
comuni per queste molecole.
27 
L’importanza dell’argomento in questione è 
evidenziata dall’accesso dibattito che vede coinvolti autorevoli gruppi di 
ricerca, tra i quali quelli dei professori Iwao Ojima, Samuel J. Danishefsky, 
e Susan B. Horwitz.
28 
La determinazione di queste analogie strutturali 
infatti non solo permetterebbe una migliore conoscenza della struttura del 
sito di binding sulla tubulina e del meccanismo d’azione, ma anche il 
disegno razionale di nuovi inibitori della depolimerizzazione dei 
microtubuli.  
 
 9
3. Obiettivi del lavoro 
 
Come già detto, gli studi conformazionali sui tassoidi si sono 
concentrati sulle conformazioni assunte in soluzione dalla catena laterale 
C13, ed in particolare sugli isomeri rotazionali lungo il legame C2’-C3’, 
allo scopo di determinare quelle più attive verso i microtubuli. La 
conoscenza delle conformazioni attive è, infatti, una tappa fondamentale 
per arricchire le nozioni riguardanti la struttura del sito di binding sulla 
tubulina e per la progettazione mirata di analoghi del paclitaxel, o di nuove 
molecole, aventi caratteristiche farmacologiche migliori. 
Con lo scopo di approfondire lo studio delle relazioni tra 
conformazione ed attività si è proceduto alla progettazione di analoghi del 
paclitaxel e del docetaxel a conformazione vincolata. I composti ciclici 
sono frequentemente usati per simulare le conformazioni bio-attive di 
sequenze lineari,
29
 perciò si è progettato l’inserimento di spaziatori tra il 
C2’ ed il carbonio in orto del fenile in C3’, dando luogo a dei cicli a cinque 
ed a sei termini rispettivamente, nei quali la rotazione attorno all’asse C2’-
C3’ è limitata (fig. 5).
30
 
 
R
1
O
OH
O
HO
H
O
O
O
O
O
OH
O
NH
R
2
O
O
n
5a  R
1
=Ac;
5b  R
1
=H;
6    R
1
=Ac;
R
2
=Ph;      n=1
R
2
=t-BuO; n=1
R
2
=Ph;      n=2
3'
1'
2'
 
Figura 5 
 10
Sono stati scelti questi derivati ciclici perchè, ad una prima analisi 
conformazionale usando modelli molecolari (Dreiding) e simulazioni al 
computer (programma Chem 3D), si è visto che la catena laterale 
dell’analogo indanico 5a, data la relativa rigidità dell’anello ciclopentenico, 
possiede una conformazione quasi eclissata al legame C2’-C3’, molto 
simile alla conformazione C del paclitaxel, mentre quella dell’analogo 
tetraidronaftalenico 6 può assumere due conformazioni, dette a mezza sedia 
(half-chair), dovute alla mobilità della porzione cicloesenica, 
rispettivamente paragonabili alla conformazione A, preponderante nei 
solventi apolari, ed alla conformazione B, riscontrabile in solventi acquosi 
(fig. 6).
30 
 
NH
OH
COOR
R
1
O
NH
OH
COOR
R
1
O
NHCOR
1
HC
6
H
5
HO
H
COO
COO
H
R
1
OCHN
C
6
H
5
HO
H
H
C
6
H
5
R
1
OCHN
HO
H
COO
AB
1'
2'
3'
4'
5'
1'
2'
3'
4'
 
Figura 6 
 
Inoltre è stato riportato che l’introduzione di un gruppo metilico in 
C2’ sulla catena laterale è ben tollerata in termini di attività biologica,
31,32 
rendendo possibile questo tipo di approccio.
 
Una volta sintetizzati, questi 
 11
analoghi a conformazione vincolata possono, quindi, essere utilizzati nei 
test di attività come inibitori della depolimerizzazione dei microtubuli, 
contribuendo all’identificazione delle conformazioni attive. 
In particolare l’oggetto di questa tesi è stato  la sintesi degli analoghi 
indanico del docetaxel 5b e  tetraidronaftalenico del paclitaxel 6 (fig. 5), 
mentre la sintesi dell’analogo indanico del paclitaxel 5a è già stata 
pubblicata dal gruppo di ricerca
 
in cui ho svolto la mia tesi.
30
  
 
 12
4. Risultati e discussione 
 
4.1. Sintesi 
Per i composti 5b e 6 è stata utilizzata una numerazione analoga a 
quella applicata al paclitaxel. 
Lavori precedenti riportano la semisintesi del paclitaxel secondo due 
vie distinte, la prima implica la condensazione della catena laterale 
sottoforma di acido carbossilico protetto con la DAB III opportunamente 
protetta,
5,8 
la seconda via, invece, prevede la reazione del β -lattame 
corrispondente alla catena laterale desiderata con la baccatina protetta.
6,33,7
 
La sintesi degli analoghi indanici e tetraidronaftalenici di paclitaxel e 
docetaxel è stata realizzata seguendo il primo tipo di approccio, come 
mostrato dal seguente schema retrosintetico (schema 1).
34
 
 
COOH
N
O
R
1
O
O
HO
BzO
O
N
O
R
1
O
AcO
HO
R
2
O
OR
3
O
HO
BzO
O
AcO
R
2
O
OR
3
O
O
DMP
DMP
n
n
+
n=1, 2
 
Schema 1 
 
La progettazione delle sintesi delle catene laterali analoghe è stata 
eseguita tenendo conto della necessità di ricalcare la stessa stereochimica 
del paclitaxel. L’analisi retrosintetica delle stesse, secondo lo schema 2, ha 
permesso di individuare nell’estere α,β insaturo C il prodotto di partenza 
dell’intera via sintetica, e nel α -idrossi-β -amminoestere B l’intermedio 
comune ad ambedue le catene laterali analoghe, visto che questi prodotti 
possono essere sintetizzati per semplice addizione dei rispettivi gruppi 
 13
acilici (benzoile e terz-butossicarbonile) all’azoto amminico, risultando un 
metodo di sintesi molto versatile. 
 
COOR'
COOR'
NH
2
OH
COOR'
NH
OH
R
O
nn
n
R=Ph; t-BuO
R'=Et
n=1, 2
A CB
n=1  13
n=2  31
 
Schema 2: analisi retrosintetica delle catene laterali analoghe. 
 
I composti C sono stati ottenuti rispettivamente dal 1-indanone 10 e 
dal α -tetralone 28, dapprima per trattamento con dietilcarbonato in 
presenza di una base forte (NaH), i relativi β -chetoesteri ottenuti (11 e 29) 
sono stati ridotti con NaBH
4 
ai corrispondenti β -idrossiesteri (12 e 30), che, 
per disidratazione catalizzata da acido p-toluensolfonico (PTSA), hanno 
dato i prodotti 13 e 31, come riportato in letteratura, dove sono reperibili 
anche i dati NMR di questi prodotti (schema 3).
35,36
 
 
OO
COOEt
OH
COOEt COOEt
n
n
nn
n=1          10                        11                                   12                               13
n=2          28                     29 30           31
 
Schema 3 
 
Per la sintesi regio ed enantioselettiva del α -idrossi-β -amminoestere B 
si è pensato di ricorrere alla recente amminossidrilazione asimmetrica (AA) 
di Sharpless,
37,38 
già utilizzata nella sintesi della catena laterale del 
 14
paclitaxel.
39 
Questa è stata la via tentata inizialmente dal gruppo di ricerca 
in cui ho svolto questa tesi sperimentale, applicandola all’estere α,β  
insaturo 13 per la sintesi del α -idrossi-β -amminoestere 23a. Il metodo 
risultava immediato e con rese del 24% rispetto al 13, comportando un 
esiguo numero di passaggi (schema 4). 
 
COOEt
COOEt
NH
2
OH
13 23a
COOEt
NH
2
OH
23b
+
 
Schema 4 
 
Questa via aveva mostrato un’eccellente regioselettività, ma non 
un’altrettanto buona enantioselettività, in quanto aveva fornito i prodotti in 
miscela quasi racemica. 
Per risolvere questo problema si è deciso di adottare una via 
alternativa di sintesi, basata sulla diidrossilazione asimmetrica (AD), anche 
questa già utilizzata nella sintesi della catena laterale del paclitaxel (schema 
5).
40,41
 
COOEt
COOEt
N
3
OH
COOEt
OH
OH
COOEt
NH
2
OH
23a
13
18a 14a
 
Schema 5: analisi retrosintetica della catena laterale analoga indanica via 
diolo vicinale come intermedio. 
 
 15
La AD, applicata al 1H-indene-2-carbossilato 13, ha dato il (2’R,3’S) 
2’,3’-diidrossiestere 14a con buone resa (65%) ed enantioselettività, 
mostrando un eccesso enantiomerico (e.e.) del 92% (schema 6). 
 
COOEt
13
COOEt
OH
OH
14a
 
Schema 6 
 
Questa reazione si è rivelata molto semplice e versatile, essendo, tra 
l’altro, disponibili in commercio le miscele dei reagenti già pronte per l’uso 
(AD mix α  e AD mix β, Aldrich). 
L’e.e. è stato determinato tramite analisi HPLC dei rispettivi 3’-
mentilcarbonati 15a e 15b, ottenuti per reazione dei dioli con (-) 
mentilcloroformiato enantiomericamente puro (schema 7).
42
 
 
COOEt
OH
OH
14a
COOEt
O
OH
O
O
15a
COOEt
O
OH
O
O
15b
+
COOEt
OH
OH
14b
+
 
Schema 7 
 
Il gruppo di ricerca di cui ho fatto parte aveva tentato la sintesi del 
composto 23a attraverso la formazione dell’ortoacetato ciclico 20, metodo 
già impiegato nelle sintesi delle catene laterali di paclitaxel e docetaxel.
40,43