Sintesi di acetamidine contenenti sistemi eterociclici a potenziale attività inibitoria sulle ossido nitrico sintasi

5 
 
Premessa 
Un gruppo di recettori nucleari, detti “recettori che attivano la proliferazione 
perossisomale” (PPARs), è stato identificato negli ultimi dieci anni. Questi 
recettori, appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari, legano diverse 
molecole, quali acidi grassi, eicosanoidi e numerose sostanze xenobiotiche 
strutturalmente diverse, note come attivatori perossisomali. 
Fino ad oggi sono stati identificati tre isotipi recettoriali relativi al gruppo dei 
recettori PPARs: PPAR/α, PPAR/β-δ e PPAR/γ. Le tre isoforme del PPAR 
posseggono profili funzionali e strutturali simili 
(1)
. 
Le patologie cardiovascolari dovute all’aterosclerosi costituiscono, attualmente, 
una delle maggiori cause di mortalità e morbosità nel mondo. Nonostante i 
notevoli progressi della medicina, infatti, gli attacchi di cuore dovuti alla 
cardiopatia coronarica (causata dall’aterosclerosi delle arterie che trasportano il 
sangue al cuore) e gli ictus (dovuti all’aterosclerosi delle arterie che trasportano il 
sangue al cervello) provocano, annualmente un numero di morti che è 2 volte 
maggiore rispetto a quello causato dal cancro e 10 volte maggiore rispetto a quello 
causato da incidenti. I fattori di rischio associati allo sviluppo dell’aterosclerosi 
includono l’ipertensione, il diabete, l’obesità, il fumo di sigaretta, ma il principale 
è rappresentato dall’iperlipidemia.
6 
 
1.1.  I PROLIFERATORI DEI PEROSSISOMI E I LORO RECETTORI 
1.1.1. I proliferatori dei perossisomi (PP) 
I “recettori dei proliferatori dei perossisomi” o PPAR (Peroxisomal Proliferator-
Activated Receptors) sono fattori di trascrizione nucleari appartenenti alla 
superfamiglia dei recettori nucleari 
(2)
. Come gli altri recettori nucleari, anche i 
PPAR vengono attivati dal legame del recettore con il suo specifico ligando. In 
particolare, i PPAR vengono attivati da ligandi definiti “proliferatori dei 
perossisomi” (PP). Tale denominazione è stata introdotta per la prima volta da 
Reddy e collaboratori 
(3)
, ad indicare una classe eterogenea di composti chimici 
capaci di indurre la proliferazione di particolari organelli definiti perossisomi, in 
fegato di topo e di ratto. L’aumento del numero e delle dimensioni dei 
perossisomi induce epatomegalia in seguito a iperplasia e ipertrofia degli 
epatociti, nei quali si evidenzia un notevole incremento della β-ossidazione degli 
acidi grassi 
(4-6)
. Successivamente, vista la persistenza di queste alterazioni 
morfologiche e metaboliche, si è dimostrato come questi agenti possono indurre 
significativamente lo sviluppo di epatocancerogenesi. Studi epidemiologici 
condotti sull’uomo con molecole di questo tipo e studi “in vivo” su epatociti 
umani hanno evidenziato che tali agenti non portano a proliferazione dei 
perossisomi né a quei fenomeni evidenziati nei roditori. Ciò è in accordo con 
l’ipotesi che tali agenti non siano cancerogeni per l’uomo o, per lo meno, l’uomo 
è sensibile solo ad alcuni degli effetti tossici esercitati dai PP 
(7)
. 
I PP possono essere sostanze normalmente presenti nell’organismo ( e vengono 
considerati ligandi endogeni), come gli acidi grassi saturi (palmitico e stearico), 
gli acidi grassi mono (oleico) e poliinsaturi (linoleico e arachidonico) e gli
7 
 
eicosanoidi (leucotrieni, prostaglandine, acido idrossi eicosatretraenoico e acido 
idrossi eicosapentaenoico) oppure sostanze di sintesi, molte delle quali utilizzate 
da tempo come farmaci (Fig.1). 
Tra le sostanze di sintesi possiamo citare: 
• agenti terapeutici: 
- farmaci ipolipidemici come i fibrati (bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, 
fenofibrato, gemfibrozil, bifonazolo, tiadenolo, Wy-14,643); 
- farmaci antidiabetici appartenenti alla classe dei tiazolidindioni (TZD) 
(troglitazone, pioglitazone, ciglitazone, englitazone, rosiglitazone); 
- farmaci antinfiammatori non steroidei e analgesici (acido acetilsalicilico, 
indometacina, fenoprofene, ibuprofene); 
• steroidi: 
- deidroepiandrosterone, 
• erbicidi, 
- acido 2,4-diclorofenossiacetico, fomesafen, lactofen, 
• materiali plastificanti: 
- DEHP: di-(2-etilesil) ftalato, 
- DEHA: di-(2-etilesil) adipato, 
- DBP: di-n-butil ftalato, 
• Solventi e sostanze chimiche industriali: 
- paraffine , percloroetilene, tricloroetilene. 
Sebbene i PP sembrino avere strutture chimiche differenti, si è osservata una 
somiglianza nella struttura tridimensionale. Una caratteristica di alcuni PP è il 
fatto di essere molecole liposolubili per la presenza di una porzione apolare
8 
 
(alifatica o aromatica) a cui è legato un gruppo polare che normalmente è un 
residuo funzionale acido. La funzione acida è essenziale per l’attività di ligando e 
consiste tipicamente in un gruppo carbossilico presente nella struttura originale o 
in un gruppo che può essere convertito metabolicamente in un gruppo carbossilico 
(11,12)
 . 
Molti di questi composti , sia naturali che di sintesi, sono comunemente diffusi ed 
utilizzati nella nostra società: i fibrati e i TZD sono usati rispettivamente nella 
terapia farmacologia dell’iperlipidemia e del diabete di tipo II, i plasticizzanti 
nelle diverse fasi della produzione delle plastiche viniliche, gli erbicidi in 
agricoltura, inoltre gli eicosanoidi, in particolare il leucotriene B4 (LTB4) e la 15-
deossi-prostaglandina J2 (15d-PG J2) da essi derivati, sono potenti mediatori dei 
processi infiammatori (fig. 1).
9 
 
 
 
 
 
  
Fig. 1: Struttura di alcuni proliferatori dei perossisomi e ligandi dei PPAR.
10 
 
 
1.1.2. I recettori dei proliferatori dei perossisomi (PPAR) 
La scoperta del primo recettore per i proliferatori dei perossisomi, nel 1990, fu 
fondamentale per la comprensione dei meccanismi proliferativi e delle risposte 
biologiche determinate da queste sostanze 
(10)
. Il recettore, attivato dal legame con 
il suo specifico ligando, forma un eterodimero con un altro recettore nucleare, il 
“recettore X per i retinoidi” o RXR (Retinoid X Receptor) 
(11-13)
, andandosi a 
legare a specifiche sequenze sul DNA denominate PPRE (PP Responsive 
Element) che si trovano su geni bersaglio. Tali sequenze sono costituite dalla 
successione di sei basi azotate ripetute due volte ed intervallate da uno spazio di 
una base azotata tra un esamero e l’altro (AGGTCA-X-AGGTCA) (fig. 2)
 (14)
. 
Una volta che l’eterodimero PPAR-RXR lega questa sequenza avrà inizio la 
trascrizione dei geni bersaglio. 
La regolazione genica esercitata dal complesso PPAR-RXR è importante 
soprattutto nel differenziamento dei preadipociti, i quali contengono una grande 
quantità di PPAR; affinché si possa vedere una risposta, è necessario che il 
complesso PPAR-RXR si sia formato e successivamente si sia legato alle 
sequenze specifiche sul DNA 
(15)
. E’ stato scoperto che anche un gran numero di 
proteine accessorie, definite coattivatori e corepressori, può legarsi ai recettori 
nucleari in modo ligando-dipendente: tali proteine, una volta legate, influiscono 
sul processo di trascrizione, rimodellando la struttura della cromatina e/o agendo 
da molecole adattatrici che legano il recettore nucleare al complesso trascrizionale 
(16)
.
11 
 
 
Fig. 2: Modulazione della trascrizione genica da parte dei PPAR. 
 
 
Il legame dei PP porta all’attivazione dei PPAR e alla eterodimerizzazione con il 
recettore RXR. L’eterodimero PPAR-RXR si lega ad una sequenza consenso sul 
DNA (PPRE) 5’-AGGTCA –x- AGGTCA AGTT-3’.  
Nell’uomo sono state individuate tre isoforme di PPAR: PPARα, PPARβ-δ e 
PPARγ. Quest’ultimo è presente in quattro isoforme γ1, γ2, γ3 e γ4, derivati dallo 
stesso gene trascritto in tre diversi mRNA per l’utilizzo differenziale di tre 
promoters e AGGTCA-X-AGGTCA per splicing alternativo 
(17)
 (fig. 3).
12 
 
  
Fig. 3: Isoforme di PPAR γ. Organizzazione genomica di hPPARr γ. 
 
 
Due isoforme originano dall’uso differenziale di tre promotori e successivo 
splicing alternativo dei tre esoni in 5’(A1, A2 e B). Gli esoni 1-6 sono comuni a 
tutti e quattro i trascritti. 
La localizzazione cromosomica dei geni dei PPAR è stata evidenziata nell’uomo e 
nel topo. Nell’uomo il gene del PPARα è localizzato sul cromosoma 22, nella 
regione 22q12-q13.1 
(18)
, il gene del PPARγ sul cromosoma 3, in posizione 3p25 
(19)
 e il gene del PPARβ/δ sul cromosoma 6, nella regione 6p21.1-p21.2 
(20)
. Le 
regioni codificanti i geni dei PPAR umani e murini sono costituite da sei esoni, 
come altri membri della superfamiglia dei recettori nucleari, presentano una 
caratteristica struttura modulare costituita da cinque o sei regioni strutturali (AF) e 
quattro domini funzionali 
(7) 
(fig. 4).
13 
 
Il dominio NH
2
-terminale A/B ospita un dominio di attivazione trascrizionale 
ligando-indipendente (AF-1) che è attivo in ogni tipo cellulare. La regione C è 
altamente conservata: presenta un sito di legame per il DNA (DBD: DNA Binding 
Domain) che consiste in due motivi “zinc fingers” disposti perpendicolarmente fra 
loro; la regione D è un’ansa flessibile che permette la corretta disposizione del 
DBD dopo attivazione del recettore dovuta al legame col ligando 
(8)
; la regione 
E/F permette il legame con il ligando (LBD: Ligand Binding Domain) e ha un 
ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, permettendo l’attivazione 
trascrizionale. Inoltre, la regione E, che presenta un dominio di attivazione 
funzionale (AF-2), è anche importante per la dimerizzazione, la localizzazione 
nucleare e l’associazione con modulatori della trascrizione (coattivatori o 
corepressori) 
(21)
. 
 
Fig. 4: Rappresentazione schematica del dominio funzionale dei PPAR. 
 
Il dominio N-terminale è il meno conservato tra le diverse isoforme, infatti la sua 
lunghezza varia dai 30 aminoacidi dei PPARβ/δ ai 112 aminoacidi del PPARγ; 
l’AF-1 presente in questo dominio è riconosciuto dalle MAPK (mitogen activated 
protein kinases) che, mediante fosforilazione, agiscono da modulatori dell’attività 
dei PPARα e γ. E’ stato dimostrato che la fosforilazione del recettore a questo 
livello indurrebbe un aumento dell’attività trascrizionale; inoltre il grado di