Sequenze Stellate nell’eucromatina del genere Drosophila

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Un differente comportamento e la diversa natura molecolare delle 
sequenze eterocromatiche permettono la distinzione di 
“eterocromatina facoltativa” e di “eterocromatina costitutiva” . 
L’eterocromatina facoltativa è costituita da singole regioni 
cromosomiche, interi cromosomi, a volte anche interi set aploidi 
(normalmente eucromatici), che assumono, nelle diverse tipologie 
cellulari o nei vari stadi di sviluppo, un alto grado di 
condensazione. Un esempio di eterocromatina facoltativa è 
l’inattivazione di uno dei due cromosomi X di mammifero. 
Fenomeno che garantisce la compensazione del dosaggio dei 
geni legati al sesso (Lyon 1972). 
L’ eterocromatina costitutiva  è una componente permanente di 
tutti i cromosomi. Si presenta come una struttura compatta 
nell’intero ciclo cellulare ed è localizzata a livello del centromero e 
dei telomeri, nelle vicinanze della regione organizzatrice del 
nucleolo; in alcuni casi può essere localizzata nell’eucromatina 
che si definisce “eterocromatina intercalare”. Oltre al suo alto 
grado di condensazione, l’eterocromatina costitutiva presenta un 
ritardo nella replicazione, una scarsa attività trascrizionale e un 
numero ridotto di geni. 
 
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1. ETEROCROMATINA IN Drosophila melanogaster  
 
L’eterocromatina in Drosophila melanogaster costituisce circa il 
30% del genoma nelle femmine e il 35% nei maschi, di cui l’intero 
cromosoma Y, il 25% degli autosomi II e III e gran parte 
dell’autosoma IV. Nella eterocromatina di  D. melanogaster sono 
stati identificati più di 30 geni,  tra cui light (lt), rolled (rl) e 
concertina (cta). Questi geni sono costituiti da una serie di piccoli 
esoni intervallati da introni molto grandi costituiti da sequenze di 
DNA satellite, trasposoni (Schupach et al.1989, Devlin et al.1990, 
Dimitri 1991, Reuter et al.1992). Nel cromosoma Y sono localizzati 
i loci Kl-1, Kl-3,Kl-5 e Ks-1 che determinano la fertilità maschile. 
Diverse caratteristiche rendono la D. melanogaster un organismo 
d’elite per lo studio dell’ eterocromatina: 
1) La breve durata del ciclo riproduttivo, questo organismo alla 
temperatura di 25°C si trasforma da uovo in organismo adulto, in 
circa undici giorni; 
2) Le dimensioni del suo genoma 1.65 x10
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pb, circa venti volte 
inferiore a quello dell’uomo, organizzato in quattro soli cromosomi; 
3) La possibilità di indurre riordinamenti cromosomici, con quantità 
variabili di eterocromatina, che permette di ottenere deficienze e 
riarrangiamenti di specifici segmenti eterocromatici; 
4) La presenza in alcuni tessuti, come le ghiandole salivari, dei 
cromosomi politenici; sono cromosomi derivanti da endomitosi 
successive. Questi cromosomi presentano un bandeggio naturale, 
che Bridges utilizzò per costruire una mappa citologica 
suddividendo l’eucromatina in 102 bande e interbande; 
5) Tecniche di colorazione citologiche permettono di visualizzare 
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nell’eterocromatina mitotica, un bandeggio differenziale. Questo 
bandeggio, conseguenza della eterogeneità delle sequenze 
eterocromatiche, ha permesso la determinazione, su neuroblasti di 
larve al III stadio, di una mappa citologica dell’eterocromatina di 
estremo valore per lo studio dell’eterocromatina. 
Sono stati identificati  dei sistemi genici definiti “sistemi criptici”  
poiché queste funzioni geniche possono essere rilevate solo se 
sono presenti specifiche mutazioni in loci eucromatici; sono i 
sistemi: crystal-Stellate; SD ( Segregation Distorsion); abo-ABO. 
 
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2. SISTEMA crystal-Stellate 
 
“crystal-Stellate” è un sistema di interazione tra eterocromatina e 
eucromatina. E’ un sistema genico multicomponente coinvolto 
nella spermatogenesi di D. melanogaster.  
Fu identificato nel 1961 da Meyer e collaboratori, i quali 
osservarono che i Maschi X/O di D. melanogaster erano 
completamente sterili e mostravano, nel citoplasma degli 
spermatociti I degli aggregati cristallini, a forma di ago o di stella. 
Studi successivi hanno permesso  di identificare che il sistema 
crystal-Stellate  era responsabile del fenotipo osservato e hanno  
evidenziato i loci coinvolti nel sistema: il locus crystal (cry) 
(Pimpinelli et al, 1986;Palumbo et al,1994) anche detto 
Soppressore di Stellate ( Su[Ste] ) nella regione eterocromatica 
h11 del cromosoma Y. Due loci nel cromosoma X, il locus Stellate 
(Ste) nella regione eucromatica 12E1 della mappa politenica e un 
locus nella regione eterocromatica h27 dei cromosomi mitotici, 
detta Ste het (Palumbo et al., 1994). In seguito ulteriori  scoperte 
hanno determinato che il tipo di aggregati, a forma di ago o di 
stella, dipende dal locus Stellate (Ste). Quest’ultimo é costituito da 
sequenze ripetute (Lovett 1983), ed in conseguenza del loro grado 
di ripetizione si ha la forma allelica Ste
+
 (15-52 copie) o Ste (250-
400) (Livak 1984; Palumbo et al. 1994). Gli aghi si osservano in 
presenza dell’allele Ste
+
, le stelle in presenza dell’allele Ste (Hardy 
et al. 1984). Inoltre, maschi X/O presentano anomalie meiotiche, 
quali difetti nella condensazione e nella segregazione dei 
cromosomi meiotici (Lyfschytz and Hareven 1977). Tale fenotipo è 
osservabile quando il cromosoma Y porta la delezione della 
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regione eterocromatica h11, dove è stato mappato il locus crystal 
(cry)  (Pimpinelli et al. 1986; Palumbo et al. 1994) o Suppressor of 
Stellate  Su (Ste)  (Livak 1990). Come conseguenza, i maschi 
XSte+/Ycry- sono semifertili, mentre quelli con XSte/Ycry- sono 
completamente sterili.  
Stellate e crystal sono composti da sequenze ripetute in parte 
identiche ( omologia del 93%).  
Il locus crystal di 2800bp è costituito da sequenze mediamente 
ripetute in numero compreso tra 80 fino a 240 volte, isolate in 
popolazioni naturali  (Lyckegaard and Clark 1989), rilevate come 
repeat di 800 bp dopo digestione con l’enzima di restrizione Cfo I.  
L’elemento crystal,  rappresentata dal clone PSY (Livak, 1990), 
consiste nelle seguenti regioni : la regione di omologia con le 
sequenze Stellate seguita da una sequenza  ricca in AT (che 
presenta omologia con il gene SSL), un segmento crystal specifico 
e l’Elemento Trasponibile Hoppel di 1360 pb.   
Sono state descritte numerose varianti nell’organizzazione 
strutturale del repeat, dovute ad eventi di ricombinazione di varia 
natura (Balakireva et al.,1992) e che sembrano poter essere 
trascritte e variamente processate (Kalmykova et al.,1997).  
Il locus Stellate genera, dopo digestione con Cfo I, tre classi di 
repeat: di 950 bp, 1100 bp, 1150 bp. Il gene Stellate  contiene due 
introni e produce un trascritto di 750 nucleotidi solo nei testicoli di 
maschi X/O o X/Ycry
-
, ed è completamente assente in maschi wild 
type (Livak 1990). 
Questo mRNA aumenta all’aumentare delle copie di Stellate. 
Questi trascritti sono assenti in maschi X/Y. Altri due trascritti 
specifici di 1200 e un mRNA di circa 8000 basi sono stati 
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riscontrati in tutti i tessuti dei maschi e delle femmine. 
L’mRNA Stellate  di 750 basi codifica per una proteina di 171 
amminoacidi ed è la componente principale dei cristalli presenti 
negli spermatociti I dei maschi X/O e dei maschi X/Ycry
-
. 
L’identificazione della proteina Stellate nei cristalli è stata  
effettuata con esperimenti di immunocolorazione dei testicoli con 
un anticorpo policlonale anti-Stellate (Bozzetti et al., 1995). 
La proteina Stellate è di circa 20 KDa. Questa proteina presenta 
una omologia del 40% con la subunità  Ε della caseina chinasi II 
(CK2) di D. melanogaster (Livak,1990). La CK2 è un’enzima 
multifunzionale e tra le sue funzioni, induce l’attivazione della 
topoisomerasi II. Quest’ultima è  responsabile della fosforilazione 
degli  istoni, modificazione indispensabile per la condensazione e 
la segregazione del cromosoma. Studi biochimici in vitro hanno 
dimostrato che la proteina Stellate compete con la normale 
subunità  Ε della caseina chinasi II nel legame alla subunità 
catalitica ∆. Questo legame può determinare una alterazione della 
CKII e di conseguenza alterare la funzionalità della topoisomerasi 
II. Essendo quest’ultima, come detto in precedenza, necessaria 
per la corretta condensazione e segregazione dei cromosomi, la 
sua alterata attività potrebbe essere responsabile dell’insorgenza 
dei difetti meiotici osservati nel fenotipo Stellate. 
L’ipotesi corrente é che il sistema crystal-Stellate sia un sistema 
“selfish”, i cui componenti sono normalmente silenti, ma che, se 
perturbati, causano disturbi nel processo meiotico e, di 
conseguenza, il proprio mantenimento.  
 
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Studi recenti hanno dimostrato che il silenziamento di Stellate é 
mediato dal RNA interference (RNAi) (Aravin et al.,2001) . L’RNA 
interference (RNAi) è un meccanismo di silenziamento genico 
molto diffuso nelle piante e in questi ultimi anni è stato riscoperto 
in molti eucarioti. L’RNAi è mediato da una molecola di RNA a 
doppio filamento (Double Stranded RNA(dsRNA)) contenente 
sequenze identiche al gene silenziato. Le molecole di dsRNA 
vengono ridotte in frammenti di 21-25 nucleotidi, definiti “ small 
interfering RNAs” (siRNA), da un enzima tipo RNaseIII, chiamato 
DICER. Gli siRNA associati ad un complesso proteico definito 
“RNA induced silencing complex” (RISC) legano i mRNAs trascritti 
dal gene endogeno, che vengono poi degradati, e il risultato è il 
silenziamento genico. 
In D. melanogaster, Aravin e collaboratori hanno dimostrato che il 
silenziamento di Stellate avviene ad un livello post-trascrizionale, 
ed è determinata dalla produzione di dsRNA. 
Con esperimenti di co-trasfezione in colture cellulari di Drosophila 
hanno dimostrato che dsRNAs di crystal causano l’eliminazione 
del trascritto Stellate, ed operano inoltre una regolazione negativa 
autogena. 
In maschi X/Y hanno isolato mRNAs sia di senso che di antisenso 
di peso molecolare compreso tra 2-3 Kb, trascritti dal locus crystal. 
siRNAs di 21-23  nucleotidi corrispondenti a questi trascritti 
determinano il silenziamento di Stellate. 
Questi ricercatori concludono che il silenziamento genico mediato 
da dsRNA inibisce l’espressione di Stellate nella linea germinale, 
assicurando la fertilità maschile in D. melanogaster. 
 
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Quanto descritto è il primo caso naturale di silenziamento mediato 
da dsRNA isolato in D. melanogaster. 
Considerazioni di ordine evolutivo, unitamente alla localizzazione 
in più siti, e al meccanismo di silenziamento per RNAi, indicano 
una probabile natura  trasposonica delle sequenze crystal e 
Stellate. 
In uno studio recente ( Usakin et al., 2005) è stato ipotizzato una 
possibile via evolutiva che nella specie D. melanogaster ha portato 
alla definizione degli elementi Stellate e Su(Ste). 
Questo “pathway” prevede una prima fase in cui un evento di 
ricombinazionenon omologa tra il promotore del gene  ΕNAC nella 
regione 12E del cromosoma X e il gene  ΕCK2tes nell’autosoma II 
ha prodotto una chimera nel cromosoma X. Gli stessi ricercatori 
ipotizzano che questo intermedio chimerico, per traslocazione sia 
passato sul cromosoma Y e non escludono l’opposto, cioè che si 
sia formato nel cromosoma Y. Successivamente eventi di 
amplificazione, di conversione genica, l’inserzione dell’Elemento 
Trasponibile Hoppel, ha generato gli elementi Su(STE) nel 
cromosoma Y e gli elementi eucromatici Ste e hetSte nel 
cromosoma X (Fig 1). 
Questi elementi hanno poi subito eventi di amplificazioni 
successive che hanno portato alla attuale situazione genomica di 
D. melanogaster.