Introduzione
I batteri lattici sono microrganismi fondamentali per la
produzione di alimenti fermentati, ossia di quegli alimenti che
si ottengono o che assumono particolari caratteristiche solo a
seguito di una determinata attività microbica (Buckenhüskes,
1993).
Tra i vari alimenti nella cui produzione sono coinvolti i
batteri lattici, rientrano anche i prodotti da forno ottenuti con
l’impiego del cosiddetto “lievito naturale” o “madre acida” o
“impasto acido” (“sour dough”). Con questo termine si indica
un impasto costituito essenzialmente di acqua e farina, che
acidifica naturalmente a seguito di fenomeni fermentativi
dovuti allo sviluppo di microrganismi contaminanti,
soprattutto lieviti e batteri lattici (Foschino et al., 1995). Si
ottiene così una coltura microbica naturale.
Durante la lavorazione del pane o degli altri prodotti da
forno questo impasto può venire utilizzato in aggiunta al
panetto di lievito industriale, o può addirittura sostituirsi ad
esso, con funzione di agente lievitante (da cui il nome di
“lievito naturale”): il suo impiego conferisce al prodotto finito
caratteristiche peculiari, che saranno descritte più avanti (vedi
paragrafo 1.4).
Introduzione
1.2 PRINCIPALI GENERI E SPECIE
DI BATTERI LATTICI
Sulla base dell’analisi della parete cellulare (Schleifer e
Kandler, 1972) e della similarità fra le sequenze dell’RNA
ribosomiale (Stackebrandt e Teuber, 1988), i principali generi
che compongono il gruppo dei batteri lattici sono, secondo
l’attuale tassonomia, i seguenti (Teuber, 1993):
Lactobacillus
Lactococcus
Leuconostoc
Streptococcus
Pediococcus
Enterococcus
Weissella (Coeuret et al., 2003).
1.2.1 Genere Lactobacillus.
La morfologia cellulare è molto variabile: certe specie
appaiono come bastoncelli lunghi e sottili, talvolta ricurvi,
mentre in altre le cellule sono corte e tozze (coccobacilli), al
punto da poter essere confuse con il gen. Leuconostoc, che ha
forma coccica. Tuttavia, all’interno di ciascuna specie, la
lunghezza varia anche con l’età della coltura, con la
composizione del mezzo e con la concentrazione di ossigeno;
inoltre in alcune specie, ad esempio Lactobacillus fermentum e
Lb. brevis, si trovano bastoncelli sia lunghi che corti (Kandler
e Weiss, 1986).
Introduzione
Per quanto riguarda invece la forma delle colonie
coltivate su substrato solido, queste appaiono piccole
(2-5 mm), con margini interi e convessi, bianche o
completamente trasparenti, in genere lisce. Lb. confusus forma
inoltre una caratteristica patina viscosa (“slime”) (Kandler e
Weiss, 1986).
Come per tutti i batteri lattici, le esigenze nutrizionali
del gen. Lactobacillus sono elevate e per garantire la presenza
di tutti i fattori di crescita necessari, i mezzi di coltura
utilizzati di solito contengono carboidrati fermentescibili,
peptone, estratto di carne ed estratto di lievito; la presenza di
supplementi come il Tween 80, un estere dell’acido oleico, è
fondamentale per molte specie (Kandler e Weiss, 1986).
Nonostante la complessità delle esigenze nutrizionali, il
gen. Lactobacillus è ampiamente diffuso (Hammes et al.,
1991): si trova infatti nell’organismo umano e animale
(soprattutto nell’intestino), negli insilati e in molti alimenti di
origine animale e vegetale, come prodotti a base di carne e di
pesce, prodotti lattiero-caseari, vino, aceto, birra, sidro e altre
bevande alcoliche ottenute dalla fermentazione di frutta o
cereali, nonché nell’impasto acido del pane.
Dal punto di vista metabolico, il gen. Lactobacillus è
diviso in tre gruppi (Kandler e Weiss, 1986):
¾ lattobacilli omofermentanti obbligati;
¾ lattobacilli eterofermentanti facoltativi;
¾ lattobacilli eterofermentanti obbligati.
Introduzione
Lattobacilli omofermentanti obbligati.
Fermentano i carboidrati esosi producendo
esclusivamente acido lattico, in ragione di 2 moli di acido
lattico per ogni mole di carboidrato fermentata. Non sono in
grado di fermentare i pentosi, e non producono gas. Tuttavia
possono produrre quantità molto piccole di acetato, CO
2
e
acetoino dalla decarbossilazione del piruvato (Schlegel, 1976).
Questo gruppo corrisponde ai “Termobatteri” di Orla-
Jensen (1919), che comprende quei batteri capaci di crescere a
45°C.
Sulla base della minore o maggiore omologia
DNA/DNA, all’interno del gruppo degli omofermentanti
obbligati si possono distinguere due sottogruppi di specie
correlate fra loro e diverse specie singole, che non hanno
alcuna particolare correlazione con le altre.
All’interno dei lattobacilli omofermentanti obbligati si
trovano diverse specie d’interesse per quanto riguarda la
produzione di pane con l’uso della pasta acida, perciò di
seguito ne viene data una breve descrizione.
Al primo dei sottogruppi in cui si possono dividere i
lattobacilli omofermentanti appartengono le tre sottospecie di
Lactobacillus delbrueckii, ossia Lb. delbrueckii subsp.
delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. lactis e Lb. delbrueckii
subsp. bulgaricus, che hanno un grado di omologia
DNA/DNA superiore all’80%, producono acido D-lattico,
sono incapaci di crescere a 15°C e si differenziano
essenzialmente per il tipo di carboidrati fermentati. In
particolare Lb. delbrueckii subsp. lactis è la specie con il
profilo fermentativo più ampio (ad esempio, a differenza delle
Introduzione
altre due specie, Lb. delbrueckii subsp. lactis è in grado di
fermentare il maltosio, uno zucchero presente nella farina, che
può essere metabolizzato solo da alcuni ceppi di Lb.
delbrueckii subsp. delbrueckii e da nessun ceppo di Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus, specie meno interessante perciò
dal punto di vista della panificazione). Data la sua capacità di
fermentare molti carboidrati, Lb. delbrueckii subsp. lactis è
probabilmente il progenitore comune di diverse altre specie,
derivate dalla prima per adattamento ad un substrato
particolare. È inoltre la specie più termofila, capace di vivere
anche a 52°C.
Il secondo sottogruppo è caratterizzato da una maggiore
eterogeneità a livello genetico ed è rappresentato dalla specie
Lactobacillus acidophilus, che produce acido lattico nelle
forme D e L, è in grado di fermentare il maltosio, non cresce a
15°C ed è in grado di fermentare l’amido (limitatamente ad
alcuni ceppi). La specie più affine a Lb. acidophilus, per
contenuto percentuale di G + C (Guanina + Citosina) nel
DNA, stesso tipo di acido lattico prodotto, e incapacità di
crescere a 15°C, è Lactobacillus helveticus, che può essere
considerato un derivato di Lb. acidophilus specializzato per la
crescita nel siero acido del latte. È quindi un microrganismo di
particolare interesse lattiero-caseario, ma lo si trova anche
nella pasta acida del pane (Foschino et al., 1995). Alcuni ceppi
sono in grado di fermentare il maltosio.
Tra le altre specie omofermentanti obbligate presenti
nella pasta acida, si trovano Lactobacillus farciminis e
Lactobacillus amylovorus (Corsetti et al., 2000). Il primo è in
grado di crescere a 15°C, produce acido lattico soprattutto
Introduzione
nella forma L, ma in misura minore anche nella forma D, ed è
in grado di idrolizzare l’arginina. Fermenta il maltosio e può
crescere in presenza del 10% di NaCl. Il secondo invece non è
capace di crescere a 15°C, produce acido lattico D e L e
presenta un’attività amilolitica extracellulare. Tuttavia, poiché
anche alcuni ceppi di Lb. acidophilus sono in grado di
idrolizzare l’amido, queste due specie possono essere distinte
con sicurezza solo a livello genetico, dato che tra loro non c’è
omologia DNA/DNA.
Lattobacilli eterofermentanti facoltativi.
Fermentano gli esosi producendo acido lattico come gli
omofermentanti, ma alcune specie, in determinate condizioni,
producono anche acido acetico, acido formico e/o etanolo.
Sono inoltre in grado di fermentare i pentosi ad acido lattico e
acido acetico.
Rappresentano gli “Streptobatteri” di Orla-Jensen,
microrganismi mesofili con temperature ottimali di crescita
comprese tra 30 e 37°C.
È un gruppo di batteri molto eterogeneo. I lattobacilli
eterofermentanti facoltativi coinvolti nella panificazione con
impasto acido sono indicati di seguito.
Lactobacillus alimentarius cresce a 15°C ma non a 45°C
ed è in grado di tollerare un 10% di NaCl nel mezzo, produce
acido lattico soprattutto in forma L, ma in misura minore
anche D, e produce acetoino dal glucosio. Non è in grado di
idrolizzare l’arginina. Oltre che dalla pasta acida del pane è
stato isolato anche dai prodotti fermentati a base di pesce e
carne.
Introduzione
Lactobacillus casei comprende quattro sottospecie: Lb.
casei subsp. casei, Lb. casei subsp. pseudoplantarum, Lb.
casei subsp. rhamnosus e Lb. casei subsp. tolerans. Tutte le
sottospecie crescono a 15°C ma non a 45°C, tranne Lb. casei
subsp. rhamnosus, che è l’unico a crescere bene sia a 15 che a
45°C. Lb. casei subsp. tolerans invece può sopravvivere per 40
secondi a 72°C, ma è anche quello che fermenta il minor
numero di carboidrati (non è capace ad esempio di fermentare
il maltosio), mentre i profili fermentativi delle altre tre
sottospecie sono piuttosto simili.
Lactobacillus curvatus prende il nome dalla forma delle
cellule che è caratteristica. Come le specie precedenti non
cresce a 45°C ma a 15°C e alcuni ceppi sono addirittura in
grado di crescere a 2-4°C. Produce acido lattico nelle forme D
e L ed è stato isolato dalla pasta acida del pane (Vogel et al.,
1996), dal latte, dagli insilati e dai prodotti a base di carne.
Lactobacillus plantarum è uno dei microrganismi più
frequentemente isolati dalla pasta acida del pane (Foschino et
al., 1995; Corsetti et al., 1994; Gobbetti et al., 1994). Cresce a
15°C ma non a 45°C e non è in grado di idrolizzare l’arginina.
Alcuni ceppi, in certe condizioni, sono capaci di ridurre il
nitrato. Il profilo fermentativo è molto ampio, ossia questa
specie è in grado di fermentare molti carboidrati, eccezion
fatta per il ramnosio. L’acido lattico è prodotto sia in forma D
che in forma L. I ceppi di Lb. plantarum sono riuniti in due
gruppi, legati fra loro da una omologia DNA/DNA del 50-
60%. In passato si considerava appartenente alla specie anche
un terzo gruppo, il cui rappresentante principale è
Lactobacillus pentosus, ma dato che la percentuale di
Introduzione
omologia a livello di DNA è più bassa rispetto a quella degli
altri due, oggi si preferisce considerare questo insieme di ceppi
come un gruppo a se stante.
Lactobacillus sakei deriva il suo nome dalla fonte
d’isolamento primaria, il vino di riso. Cresce a 15°C e non a
45°C, ma, come per il Lb. curvatus, alcuni ceppi sono in grado
di vivere a 2-4°C. Produce D e L acido lattico e non è in grado
di idrolizzare l’arginina. Lo spettro di fermentazione è
abbastanza ampio. È tipico dei cibi fermentati di origine
vegetale (es. crauti) ed è stato isolato anche dalla pasta del
pane preconfezionata.
Lattobacilli eterofermentanti obbligati.
Fermentano gli esosi producendo acido lattico, CO
2
e
acido acetico e/o alcol etilico in quantità equimolare (1 mole di
acido lattico, 1 mole di CO
2
e 1 mole di acido acetico/alcol
etilico per ogni mole di zucchero fermentata). Sono capaci di
fermentare anche i pentosi con produzione di acido lattico e
acetico.
Questo gruppo corrisponde ai “Betabatteri” di Orla-
Jensen, i microrganismi eterofermentanti produttori di gas.
Tutte le specie di questo gruppo producono acido lattico
in entrambe le forme, D e L, tranne Lactobacillus fructosus,
che produce quasi esclusivamente D acido lattico, e
Lactobacillus divergens che produce solo la forma L.
Lactobacillus bifermentans ha la particolarità di
fermentare il glucosio a D/L acido lattico in modo
omofermentante, ma poi l’acido lattico prodotto è convertito,
Introduzione
più o meno rapidamente in dipendenza del pH, ad acido
acetico, CO
2
e H
2
.
In generale i lattobacilli eterofermentanti obbligati
costituiscono un gruppo molto eterogeneo, sia per quanto
riguarda i profili fermentativi, sia per il livello di omologia
DNA/DNA, sia per la percentuale di G + C. Le uniche due
specie più vicine dal punto di vista dell’omologia DNA/DNA
(40%) sono Lactobacillus kefir e Lactobacillus buchneri.
Le specie di maggior interesse per quanto riguarda la
produzione di pane con impasto acido sono le seguenti.
Lactobacillus sanfrancisciensis: è il lattobacillo tipico
degli impasti acidi di cui è considerato il microrganismo
chiave (Gobbetti e Corsetti, 1997). La specie, descritta per la
prima volta nel 1971 (Kline e Sugihara), è stata isolata dal
pane di San Francisco, da cui il nome. È in grado di utilizzare
maltosio e glucosio come fonti di energia ed è capace di
produrre elevate quantità di acido lattico, determinando in tal
modo un abbassamento del pH del mezzo fino a valori di 3.8
(Foschino et al., 1995).
Cresce a 15°C ma non a 45°C e non è in grado di
idrolizzare l’arginina. Può essere coltivato sul terreno MRS
solo dopo aggiunta di estratto di lievito fresco (vedi il capitolo
Materiali e metodi, paragrafo 2.3.3) e dopo aver abbassato il
pH del mezzo al valore di 5.6.
Tramite l’omologia DNA/DNA è stato dimostrato che il
Lactobacillus brevis subsp. lidneri, inizialmente considerato
una specie diversa, corrisponde in realtà al Lb.
sanfrancisciensis.
Introduzione
Maggiori informazioni sull’importanza di questa specie
nell’ambito degli impasti acidi sono riportate al paragrafo
1.5.1.
Lactobacillus brevis cresce a 15°C ma non a 45°C ed è
in grado di idrolizzare l’arginina liberando ammoniaca. Può
essere facilmente confuso con Lb. buchneri, Lb. hilgardii, Lb.
collinoides e Lb. kefir, anche perché il profilo fermentativo
non è sufficiente a distinguere queste specie, e quindi è
necessario ricorrere all’omologia DNA/DNA.
Lactobacillus fermentum è uno dei pochi
eterofermentanti obbligati che non cresce a 15°C mentre si
sviluppa bene a 45°C, come del resto Lb. reuteri, da cui può
essere distinto con sicurezza solo sulla base della percentuale
di G + C dell’acido nucleico. È in grado di idrolizzare
l’arginina ed è considerato, sulla base dell’omologia
DNA/DNA, strettamente affine a Lb. cellobiosus.
Lactobacillus fructivorans è acidofilo, tanto che non
cresce oltre pH 6, mentre è favorito da un pH pari a 5-5.5.
Come la maggior parte degli eterofermentanti obbligati non
cresce a 45°C ma a 15°C e le sue esigenze nutrizionali sono
molto precise, almeno quando lo si isola per la prima volta.
Tuttavia, nei passaggi successivi d’isolamento, alcuni ceppi
diventano capaci di crescere anche in MRS liquido. Lo spettro
fermentativo è piuttosto ristretto: in pratica è in grado di
metabolizzare solo fruttosio, glucosio e ribosio. Alcuni ceppi
però fermentano anche il maltosio. È in grado di idrolizzare
l’arginina.
Introduzione
Lactobacillus viridescens ha, come il precedente, uno
spettro di fermentazione abbastanza ristretto: metabolizza
glucosio, fruttosio, maltosio e mannosio, alcuni ceppi anche
saccarosio e trealosio. Non cresce a 45°C ma solo a 15°C e
non è in grado di idrolizzare l’arginina.
Recentemente al gruppo dei lattobacilli eterofermentanti
obbligati si sono aggiunte due nuove specie, isolate per la
prima volta dalla pasta acida ottenuta con farina di segale,
utilizzata soprattutto in Germania e nei Paesi dell’Europa del
Nord per produrre il pane di segale. Si tratta di Lactobacillus
pontis (Vogel et al., 1994) e Lactobacillus panis (Wiese et al.,
1996).
La prima specie è strettamente correlata con
Lactobacillus reuteri, da cui è stata distinta tramite l’analisi
della parete cellulare e il confronto delle sequenze 16S
dell’RNA ribosomiale (Vogel et al., 1994). Raggruppa diversi
ceppi con profili fermentativi più o meno ampi: alcuni sono in
grado di fermentare solo ribosio e fruttosio e vivono in stretta
associazione con Lactobacillus sanfrancisciensis, altri invece
fermentano un maggior numero di carboidrati, tra cui anche
maltosio, glucosio e saccarosio. Tutti i ceppi producono acido
lattico nelle forme D e L, idrolizzano l’arginina e crescono a
15°C. I ceppi che non usano il glucosio sono però capaci di
produrre gas dal fruttosio (Vogel et al., 1994).
La seconda specie è morfologicamente e
fisiologicamente molto simile a Lactobacillus oris, da cui può
essere distinta con sicurezza solo tramite l’analisi delle
sequenze 16S del DNA ribosomiale o rDNA (Wiese et al.,
1996). È in grado di crescere a 30°C e anche a 45°C, ma non a
Introduzione
15°C. Produce acido lattico D e L e il profilo fermentativo è
piuttosto ampio: tra i principali carboidrati che Lactobacillus
panis utilizza si trovano infatti fruttosio, galattosio, glucosio,
lattosio, maltosio e melibiosio. Non è in grado di idrolizzare
l’arginina.
Oltre ad essere simili alle altre specie di lattobacilli
tipiche degli impasti acidi, Lactobacillus panis e Lattobacillus
pontis sono piuttosto simili tra loro, tanto da poter essere
distinte con certezza solo a livello genetico, tramite l’utilizzo
di una reazione di PCR specie-specifica
1
(Müller et al., 2000).
1.2.2 Genere Lactococcus.
Il genere Lactococcus comprende batteri lattici di forma
coccica, con una temperatura ottimale di crescita di 30°C, in
grado comunque di crescere a 10°C o anche meno, ma non a
45°C e non in presenza del 6.5% di NaCl (Schleifer in
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1986).
Il metabolismo delle specie appartenenti a questo genere
è di tipo omofermentante obbligato, con acido L-lattico come
principale prodotto della fermentazione (Teuber et al., 1991).
Il genere Lactococcus comprende sostanzialmente poche
specie, di cui tre di particolare interesse lattiero-caseario:
Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp.
cremoris, entrambe capaci di crescere su un substrato
contenente fino al 2% di NaCl, e Lactococcus lactis subsp.
1
Un esempio di reazione di PCR specie-specifica è riportato nel capitolo Materiali e metodi,
paragrafo 2.8.
Introduzione
diacetylactis, che è capace di utilizzare l’acido citrico per
produrre acetoino e diacetile. Queste tre specie sono tutte
strettamente legate dal punto di vista dell’omologia a livello di
DNA.
Alle tre sottospecie di Lactococcus lactis si aggiungono
Lactococcus garviae, considerato un probabile agente di
mastite (Teuber et al., 1991), Lactococcus plantarum e
Lactococcus raffinolactis.
Nessuna delle specie del genere Lactococcus è
particolarmente interessante dal punto di vista della
panificazione con l’uso di madre acida.
1.2.3 Genere Leuconostoc.
Comprende batteri di forma coccica, distinguibili dal
genere Lactococcus per la produzione di gas. Tutte le specie
del genere Leuconostoc hanno infatti metabolismo
eterofermentante. Sono ampiamente diffusi in natura,
specialmente sui substrati di origine vegetale, anche se le loro
esigenze nutritive sono molto elevate, come per i lattobacilli
(Holzapfel e Schillinger, 1991).
Hanno temperature ottimali di crescita comprese tra 20 e
30°C e sono meno acidofili dei lattobacilli, preferendo
substrati debolmente acidi o del tutto neutri, tranne per quanto
riguarda Leuconostoc oenos (riclassificato recentemente come
Oenococcus oenos), che è adattato al pH basso del vino (è
l’agente della fermentazione malolattica dei vini).
Introduzione
Sono anaerobi aerotolleranti. Molte specie formano una
caratteristica pellicola (“slime”) e alcune si distinguono per via
del loro pigmento giallo limone (Holzapfel e Schillinger,
1991).
Il genere Leuconostoc è di grande interesse dal punto di
vista lattiero-caseario: comprende infatti diverse specie
utilizzate come starter
2
per burro e formaggi perché in grado di
produrre acetoino e diacetile a partire dal citrato del latte e
quindi di conferire aroma al prodotto finito.
Per quanto riguarda invece la panificazione con la madre
acida, le specie d’interesse sono indicate di seguito.
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides è in
grado di fermentare L-arabinosio, fruttosio, saccarosio e
trealosio e, soprattutto se si trova a 20-25°C, produce, a
partire dal saccarosio, una caratteristica patina di destrano che
lo protegge dal calore. La maggior parte dei ceppi è anche in
grado di fermentare il maltosio. Non produce alcun pigmento.
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ha
caratteristiche simili al precedente, anche se l’attività di
produzione di destrano dal saccarosio è minore e lo spettro
fermentativo è più ridotto (Schleifer, 1986). Cresce anche a
37°C.
Leuconostoc citreum fermenta fruttosio, maltosio,
mannosio, saccarosio e trealosio. Molti ceppi producono un
pigmento giallo.
2
Si definisce “starter” una preparazione contenente microrganismi vivi di cui si sfrutta l’attività
metabolica. Questa coltura microbica viene aggiunta alla materia prima per avviare e regolare il
processo fermentativo, in modo che il prodotto finito abbia determinate caratteristiche
(Buckenhüskes, 1993).
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