Ruolo dei geni Prep nello sviluppo embrionale di Danio rerio

7INTRODUZIONE
I vertebrati presentano uno schema corporeo segmentale che appare evidente nel
tronco e nella coda, dove fin dalle prime fasi dello sviluppo il mesoderma dorsale si
suddivide nei somiti, precursori di metamerici di vertebre e muscoli. Altre strutture
metameriche sono i nervi spinali che fuoriesono a coppie ai lati di ogni vertebra. La
testa è solo apparentemente priva di segmentazione e nello sviluppo precoce dei
vertebrati si evidenzia che questa metameria interessa strutture di origine
mesodermica, neurodermica ed endodermica. I nervi cranici possono essere
paragonati in base al tipo di fibre nervose, alle radici dei nervi spinali oppure ai nervi
spinali di anfiosso e lampreda in cui le radici dorsale e ventrale rimangono
completamente separate. Le radici ventrali dei nervi spinali sono quelle che
accolgono solo fibre motrici somatiche ed innervano i muscoli somatici; questi ultimi
si sviluppano dai miotomi dei somiti, e i somiti sono strutture metameriche. Per
questa ragione le radici ventrali sono delle strutture segmentali. Nel capo, come nel
tronco e nella coda le fibre motrici somatiche sono connesse con i miotomi. Tre
piccoli e piuttosto aberranti somiti pre-otici danno origine ai muscoli estrinseci
dell’occhio; ciascuno ha il proprio nervo, rispettivamente il III, il IV ed il VI. I somiti
posteriori del capo formano i muscoli ipobranchiali nei pesci e la muscolatura della
lingua nei tetrapodi e sono innervati dai nervi spino-occipitali e dall’ipoglosso (XII)
loro omologo nei tetrapodi, tutti questi costituiti esclusivamente da fibre somato-
motorie. La disposizione segmentale è mantenuta. Il problema sorge quando si
sviluppa l’orecchio interno, questo occupa lo spazio che dovrebbe di norma contenere
dei somiti e, necessariamente, la sequenza dei somiti viene interrotta. I nervi formati
dalle radici dorsali, o branchiali, costituiscono una serie che però non è connessa ai
miotomi o ad altre strutture somatiche, ma ad elementi viscerali, sia scheletrici che
8muscolari, associati alle branchie. Perciò, il trigemino (V) è il nervo dell’arco
mandibolare, il faciale (VII) dello ioideo, il glossofaringeo (IX) innerva il primo arco
branchiale, mentre gli altri quattro archi branchiali sono innervati ciascuno da una
branca del nervo vago (X). Quindi si può ipotizzare che ci sia un unico schema
corporeo al quale ubbidiscono i miotomi, i nervi cranici, gli archi viscerali e le tasche
branchiali. In questo contesto si inserisce la capacità di alcune cellule di migrare
durante lo sviluppo embrionale, le cellule delle creste neurali hanno questa attività,
sono pluripotenti, ed esclusivamente nella testa danno origine a tessuti come
cartilagini e ossa che altrove derivano dal mesoderma. Si può affermare che la
“faccia” è in gran parte il prodotto delle creste neurali cefaliche e il differenziamento
della mandibola, dei denti, e delle cartilagini della faccia dipende dalla localizzazione
di queste cellule. Il romboencefalo è segmentato lungo l’asse antero-posteriore in
rombomeri. In pollo le creste neurali della testa migrano in base al loro rombomero di
origine attraverso tre principali vie (Figura 1) (Creuzet et al., 2002; Lumsden e
Keynes 1989). Nella prima di queste vie le cellule derivate dal mesencefalo e dai
primi due rombomeri migrano nell’arco mandibolare e generano il ganglio del
trigemino. Nella seconda le cellule derivate dal rombomero 4 migrano nell’arco
ioideo e originano i gangli del faciale e dello stato-acustico (VIII). Nella terza via le
cellule delle creste neurali che derivano dal rombomero 6, migrano negli archi
branchiali, danno origine a ghiandole (timo, tiroide e paratiroidi) e ai gangli del
Figura 1: Rappresentazione
schematica della migrazione
delle creste neurali in un
embrione di pollo. I numeri
romani indicano i nervi cranici
che innervano gli archi viscerali
indicati dai numeri arabi 1-4.
Abbreviazioni: 1, arco
mandibolare; 2, arco ioideo; 3-
4; primo e secondo arco
branchiale; Di, diencefalo;
Ames, mesencefalo anteriore;
Pmes, mesencefalo posteriore;
NFB, abbozzo naso-frontale;
r1-8, rombomeri, r8 si sviluppa
tardivamente rispetto agli altri
rombomeri (Creuzet et al.,
2002).
9glossofaringeo e del vago. Le cellule delle creste neurali derivate dai rombomeri 3 e 5
muoiono per apoptosi, o si uniscono all’uno o all’altro dei vicini gruppi migranti. Nei
mammiferi gli archi viscerali permangono negli individui adulti e corrispondono agli
ossicini dell’orecchio medio, martello, incudine e staffa, allo ioide e alle cartilagini
della laringe.
Alla base di questi processi differenziativi si trovano determinati geni regolatori
che, generalmente, codificano per specifici fattori trascrizionali. Questi ultimi
regolano l’espressione di geni bersaglio che, come parte di una complessa cascata di
segnali intracellulari, intervengono nel differenziare le specifiche regioni del tubo
neurale.
1. Le Omeoproteine (“H meodomain proteins”)
Un importante gruppo di fattori trascrizionali è caratterizzato da una regione
proteica definita omeodominio, altamente conservato dal lievito all’uomo. Attraverso
di esso, le proteine sono in grado di legarsi al DNA e regolare l’espressione dei geni
bersaglio, giocando un ruolo essenziale nel processo di differenziamento del sistema
nervoso. Nei vertebrati i geni hox spec f cano, ad esempio, la precisa identità dei
rombomeri, i diversi segmenti del romboencefalo (Krumlauf, 1994; Lumsden e
Krumlauf, 1996; Moens e Prince, 2002; Prince et al., 1998). L’inattivazione di geni
hox espressi dalle creste neurali della testa dà luogo alla perdita di identità della
regione di interesse che acquisisce le caratteristiche morfologiche di quelle vicine, e
anche da trapianti di cellule delle creste neurali dalla loro sede di origine in un
contesto cellulare, si dimostra che esse hanno già un’identità definita e determinano la
morfologia della struttura a cui appartengono.
Le proteine contenenti un omeodominio (“Homeod main proteins”) cost tuiscono
una super-famiglia di fattori di trascrizione caratterizzati da un dominio molecolare di
60 amminoacidi (omeodominio) che si lega a determinate regioni del DNA. In questo
modo vengono attivate precise batterie di geni  che specificano le proprietà di ogni
segmento del corpo. Questi fattori di trascrizione sono infatti fondamentali per il
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corretto sviluppo di un asse A/P sia nei vertebrati che negli invertebrati.
L’omeodominio è codificato da una sequenza di DNA di 180 pb altamente
conservata e conosciuta come “homeobox” (individuato per la prima volta nel 1984
all’interno dei geni omeotici Antp eUbx di D. melanogaster). Attraverso questa
regione, la proteina è in grado di legarsi a specifiche sequenze di DNA, regolando
l’espressione genica. La funzione di questi fattori di trascrizione è quindi essenziale
per specificare, nel corso dello sviluppo embrionale, il destino differenziativo di ogni
cellula.
A livello molecolare, l’omeodominio possiede una struttura secondaria definita da
tre α-eliche. Due di esse generano una conformazione a “elica-giro-elica” (“helix-
turn-elix”), caratteristica di quei fattori trascrizionali che si legano al solco maggiore
del DNA. La terza α-elica, invece, è la regione di amminoacidi in grado di
riconoscere e legare in maniera specifica le basi puriniche e pirimidiniche.
Una proteina che possiede un omeodominio è quasi certamente un fattore
trascrizionale. Di conseguenza, i geni che contengono un homeobox (omeogeni)
risultano essere elementi fondamentali per la regolazione dell’espressione genica e
per il corretto sviluppo embrionale. Questo ha spinto la ricerca ad individuare un
numero molto elevato di omeogeni contenenti un homeobox m lto conservato. Sulla
base della sequenza amminoacidica primaria, gli omeodomini possono essere
suddivisi in classi differenti,  a seconda del loro grado di omologia con la sequenza
prototipo codificata dall’homeobox del gene omeotico Antp di D. melanogaster.
2. I geni hox
Nei vertebrati, il gruppo più conosciuto e studiato di omeoproteine viene
codificato dai geni hox, espressi nel romboencefalo ed in regioni posteriori, che
governano lo sviluppo del corpo lungo l’asse cefalo-caudale, attraverso
un’espressione combinata ma selettiva per ciascun segmento (Krumlauf, 1994;
Moens e Prince, 2002). In tutti i vertebrati la polarità cefalo-caudale viene specificata
attraverso l’espressione dei geni hox già alla gastrulazione. Questi geni sono gli
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omologhi di quelli che costituiscono, in D. melanogaster, il complesso omeotico
(HOM-C) (Lewis, 1978) e giocano un ruolo fondamentale nello specificare l’identità
dei diversi segmenti lungo l’asse A/P dell’embrione. Il complesso HOM-C
comprende due gruppi di geni (i primi homeobox ad essere stati scoperti) sul
cromosoma 3, definiti come Ante napedia e Bithorax (figura 2), i quali possono
essere però considerati un’unica unità funzionale (in altri insetti, come il Tribolium ,
nel nematode Caenorhabditis elegans e n ll’anfiosso esiste un unico complesso
omeotico). I geni del complesso HOM-C sono disposti sul cromosoma nello stesso
ordine con cui vengono espressi lungo l’asse antero-posteriore del corpo. Il gene
labial, ad esempio, è quello più vicino all’estremità 3’ e regola lo sviluppo delle
strutture più anteriori. Al contrario il gene AbdB, he si tr va più spostato verso il 5’,
specifica lo sviluppo della porzione più posteriore dell’addome. L’espressione di ogni
gene omeotico determinerà, infine, il fenotipo di ogni cellula che, assieme alle altre,
contribuirà all’identità complessiva del segmento al quale appartiene.
Il fenotipo risultante da mutazioni in uno di questi geni consiste in una
Figura 2: Rappresentazione grafica dei due complessi omeotici situati sul cromosoma 3 di D.
melanogaster. Una prima regione, definita Ant nnapedi, contiene i geni labial (lab),
proboscipedia ( b), deformed (dfd), sex combs reduced (scr) ed antennapedia (antp). I geni lab e
dfd specificano i segmenti della testa, mentre scr eantp conferisco o l’identità ai segmenti
toracici. La funzione di pb sembra essere importante solo nell’adulto ma, in sua assenza, i palpi
labiali divengono zampe in seguito ad una trasformazione omeotica (Wakimoto et al., 1984;
Kaufman et al., 1990). La seconda regione cromosomica è definita Bith rax e contiene i geni
ultrabithorax (ubx), abdominalA (AbdA) e abdominalB (AbdB). Ubx specifica l’identità del terzo
segmento toracico mentre AbdA e bdB sono geni essenziali per il corretto sviluppo dei segmenti
addominali. A tennapedia e Bithorax costituiscono, nell’insieme, un'unica unità funzionale
definita complesso omeotico HOM-C.
Complesso Antennapedia Complesso Bithorax
lab Pb Dfd Scr Antp     UbxAbdA AbdB
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trasformazione di strutture appartenenti ad un segmento in quelle appartenenti ad una
altro ( meosi): ad esempio si sviluppa un’antenna al posto di una zampa.
La funzione dei geni omeotici di D. melan gaster rispecchia quella svolta dai geni
hox dei vertebrati. Diversi esperimenti hanno infatti dimostrato che mutazioni a cui
consegue la perdita di funzione di uno o più geni h x, causano la scomparsa
dell’identità di determinati segmenti lungo l’asse A/P del corpo (Rijli et al., 1993;
Gendron-Maguire, 1993; Horan t al., 1 95; Studer, 1996). Contrariamente al
moscerino della frutta, i vertebrati possiedono più gruppi di geni omeotici disposti
ognuno su un cromosoma differente, probabilmente originatisi nel corso
dell’evoluzione mediante un meccanismo di duplicazione e divergenza. Nei tetrapodi,
ad esempio, esistono quattro “clusters”di geni hox(hox a-d), come nel topo,
nell’uomo e nel pollo (McGinnis e Krumlauf, 1992). D. rerio ed altri teleostei
possiedono, invece, sette gruppi di geni hox (Prince et al., 1998; Amores et al., 1998)
e ciò suggerisce un’ulteriore evento di duplicazione genica nella linea evolutiva degli
organismi appartenenti a quest’ordine. Nonostante queste differenze, in tutti i
vertebrati possiamo riconoscere 13 gruppi paraloghi di geni hox, ognuno dei quali
comprende i geni equivalenti dei diversi complessi omeotici che mostrano un’estesa
omologia di sequenza (figura 3).
Cambiamenti nell’espressione di geni hox cau ano trasformazioni omeotiche per
cui, ad esempio, le strutture più anteriori possono acquisire il carattere di regioni più
caudali (Krumlauf, 1994). Come in D. melanogaster è stato dimostrato che anche nei
vertebrati l’espressione di ogni gene h x rispecchia la sua posizione all’interno del
complesso omeotico sul cromosoma (colinearità): ad esempio il gene più spostato
verso l’estremità 3’ è quello espresso più anteriormente nell’embrione e mano a mano
che ci si avvicina al 5’ l’espressione genica si fa più caudale. (Gaunt t al., 1988;
Graham et al., 1989; Peterson et al., 1994; Duboule e Dolle, 1989; Dekker et al.,
1992; Godsave et al., 1994).
Nella maggior parte dei casi, l’espressione dei geni hox è strettament correlata
con i confini tra i vari segmenti od i punti di maggior transizione morfologica lungo
l’asse dell’embrione (Burke et al., 1995; Horan et al., 1995; Lumsden e Krumlauf,
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1996;). Questo è evidente soprattutto a livello del romboencefalo, suddiviso lungo
l’asse rostro-caudale in una serie di segmenti definiti rombomeri che giocano un
ruolo importante nell’organizzazione e nella funzione della testa dei vertebrati
(Guthrie, 1996; Lumsden e Krumlauf, 1996). I rombomeri rappresentano zone di
sviluppo separate ognuna con un differente destino differenziativo e danno origine, ad
Gruppi paraloghi
    Topo-Hoxa
Zebrafish - hoxaa
        hoxab
     Hoxb
 hoxba
        hoxbb
  Hoxc
 hoxca
 hoxcb
    Hoxd
hoxda
A
B
C
D
Figura 3: Rappresentazione grafica dell’organizzazione dei geni Hox in topo ed in zebrafish. Come
si può notare, i geni Hox di topo (raffigurati in arancione) sono distribuiti in quattro “clusters”
omeotici (A, B, C, D) localizzati ognuno su un diverso cromosoma. In zebrafish, invece, sono
presenti sette gruppi di geni Hox (in verd ). I “clusters” genici derivati tramite duplicazione dei
gruppi Hoxa, Hoxb, Hoxc e Hoxd sono indicati come Hoxaa/Hoxab, ba/Hoxbb etc. Ognuno dei
13 gruppi paraloghi comprende geni Hox con alta omologia di sequenza. Tutti i geni di uno stesso
insieme, infatti, derivano da duplicazioni multiple iniziate da un unico gene Hoxancestrale.  Il
rettangolo nel “cluster” hoxaa di zebrafish rappresenta uno pseudogene omeotico.