Regolazione della biosintesi del NAD: una nuova attività enzimatica associata al fattore di trascrizione NadR da Escherichia coli

NadR E. coli: Introduzione.  
2
      Nell’ossidazione dei substrati, il NAD
+
 è il principale accettore di elettroni 
per la formazione di adenosina trifosfato (ATP). Il residuo coinvolto è l’anello 
piridinico (fig. 2): durante l’ossidazione del substrato, uno ione idruro (un 
nucleo di idrogeno con due elettroni) viene trasferito sul C4 dell’anello 
piridinico del NAD
+
, che quindi si riduce a NADH; durante la riduzione del 
substrato, uno ione idruro viene trasferito dal C4 dell’anello piridinico del 
NADH, che si riossida a NAD
+
. 
 
 
Figura 2. L’anello di nicotinammide è la parte reattiva del NAD
+
 nelle reazioni di 
ossido-riduzione. 
 
 
 
      In aggiunta, il NAD
+
 è substrato di reazioni che sfruttano l’energia 
liberata dalla rottura dei legami altamente energetici presenti nella molecola. 
Negli eubatteri, la scissione del legame pirofosforico, con liberazione di 
nicotinammide mononucleotide (NMN) e adenosina monofosfato (AMP), è 
NadR E. coli: Introduzione.  
3
utilizzata per l’attivazione della DNA ligasi, uno degli enzimi della 
replicazione del DNA. 
      Sempre negli eubatteri, con la rottura del legame N-glicosidico, viene 
liberato un residuo di ADP-riboso che, a livello della membrana plasmatica 
e/o del citoplasma, legato covalentemente a una proteina accettrice, ne 
modula l’attività. La reazione è catalizzata dalle mono ADP-ribosiltrasferasi 
(1). Negli eucarioti, invece, la reazione è una poli ADP-ribosilazione e 
l’enzima è una poli ADP-riboso polimerasi, capace di legare covalentemente 
polimeri di ADP-riboso a proteine accettrici coinvolte in importanti eventi 
nucleari quali la riparazione del DNA, l’espressione genica ed il 
differenziamento cellulare (2, 3). 
      Infine, un gruppo di enzimi denominati NAD
+
 glicoidrolasi catalizza 
l’idrolisi del NAD
+
 a nicotinammide e ADP-riboso noché la conversione di 
quest’ultimo ad ADP-riboso ciclico, un potente fattore che modula il rilascio 
del calcio intracellulare (4, 5). 
      Il NAD
+
 è quindi un composto indispensabile per la cellula (durante la 
crescita esponenziale di Escherichia coli la concentrazione del nucleotide 
piridinico è 1,3 mM): pertanto i livelli intracellulari debbono essere 
accuratamente mantenuti costanti, attraverso una fine regolazione delle sue 
vie di sintesi e di degradazione. 
NadR E. coli: Introduzione.  
4
      Attualmente l’unico regolatore conosciuto della biosintesi del NAD
+
 è la 
proteina NadR, presente solo negli eubatteri. In Escherichia coli e Salmonella 
typhimurium, NadR, indicato da alcuni come NadI (8, 9, 19, 20), agisce come 
repressore della  trascrizione di nadA e nadB, due geni della sintesi de novo, e  
di pncB, un gene di una delle vie di recupero (6, 7, 8). 
Biosintesi del NAD
+
 negli eubatteri. 
Sintesi de novo. 
      Esistono due principali vie biosintetiche del NAD
+
: la prima, presente 
negli eucarioti, inizia dalla degradazione aerobica del triptofano, l’altra è 
tipica degli eubatteri ed avviene in anaerobiosi. Entrambe le vie portano alla 
formazione dell’acido chinolinico (QA) e quella che converte questo a NAD
+
 
è comune a tutti gli organismi (10, 11). 
      Negli eubatteri, dunque, la sintesi de novo procede anaerobicamente 
attraverso una prima reazione di condensazione tra L-aspartato e 
diidrossiacetonefosfato (DHAP), catalizzata dal sistema della chinolinato 
sintetasi, un complesso di due enzimi. Il gene nadB codifica per il primo 
enzima del complesso: l’L-aspartato ossidasi, che converte l’L-aspartato in 
immino aspartato; il gene nadA codifica per il secondo enzima del sistema: la 
chinolinato sintetasi che catalizza la condensazione dell’immino aspartato con 
il DHAP, per dare QA (10, 11). Un unico enzima, la chinolinato 
NadR E. coli: Introduzione.  
5
fosforibosiltrasferasi (QPRTasi), interviene nel passaggio da QA a desamido 
NMN (NaMN); la nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi (NMN-
AT), utilizzando ATP, adenila NaMN a desamido NAD
+
 (NaAD
+
). Infine 
l’enzima NAD
+
 sintetasi catalizza la reazione di amidazione del NaAD
+
, con 
produzione di NAD
+
 (10, 11) (fig. 3). 
 
 
 
 
 
Figura 3. Sintesi de novo del NAD
+
 negli eubatteri. Enzimi: (1) L-aspartato ossidasi; 
(2) chinolinato sintetasi; (3) chinolinato fosforibosiltrasferasi; (4) nicotinammide 
mononucleotide adeniltrasferasi; (5) NAD
+
 sintetasi. (Asp: aspartato; IA: 
imminoaspartato; QA: chinolinato; DHAP: diidrossiacetonefosfato).  
 
 
 
Vie di recupero. 
      Una volta sintetizzato, il NAD
+
 è utilizzato per molteplici scopi e 
sottoposto a un continuo turnover: esistono più vie di recupero dei prodotti di 
NH
2
COOH
COOH
NH
COOH
COOH
PO
4
O
OH
N
COOH
COOH N
+
COOH
R P
N
+
COOH
R P P R
Ad N
+
CONH
2
R P P
Ad
nad B nad A nad C nad D nad E
NADNaADNaMN
QA
DHAP
IAAsp
1 2 3
4 5
NadR E. coli: Introduzione.  
6
degradazione del dinucleotide, complessivamente note come Ciclo dei 
Nucleotidi Piridinici, PNC (10, 11). 
      In Escherichia coli e Salmonella typhimurium sono conosciute due vie di 
recupero operanti a livello della membrana cellulare (10) (fig. 4 e 5).  
La principale via di recupero è schematizzata in fig. 4 e comprende 1a) 
l’idrolisi del legame pirofosforico del NAD
+
 con formazione di NMN e AMP; 
2a) la deamidazione dell’NMN a NaMN; 3a) la formazione di NaAD
+
 a 
partire da NaMN e ATP e 4a) infine la conversione di NaAD
+
 a NAD
+
. 
Questo ciclo è noto come PNC IV (10).  
      La seconda via, indicata come PNC VI (10) e illustrata in figura 5, 
procede con 1b) la rottura del legame pirofosforico del NAD
+
 e liberazione di 
AMP e NMN; 2b) l’idrolisi del legame glicosidico dell’NMN con formazione 
di nicotinammide (Nm); 3b) la deamidazione della nicotinammide a 
nicotinato (NA); 4b) la conversione di NA a NaMN catalizzata dalla 
nicotinato fosforibosiltrasferasi (NaPRTasi), codificato dal gene pncB. In 
Escherichia coli, l’enzima è sotto il controllo repressivo del nicotinato (11) e 
attraverso tale repressione, la cellula modula i livelli intracellulari di NAD
+
 
(10). Infine le ultime due reazioni del ciclo sono la 3a) e la 4a), descritte per il 
ciclo PNC IV.  
 
NadR E. coli: Introduzione.  
7
 
 
 
 
Figura 4. PNC IV. Enzimi: (4) nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi; (5) 
NAD
+
 sintetasi; (6) DNA ligasi; (11) NMN deamidasi; (10) NAD
+
 pirofosfatasi.  
N
+
R P
N
+
R
COOH
P P R
Ad
N
+
R P P R
CONH
2
Ad
NaMN NaAD NAD
nad D
nad E
4
5
N
+
R P
CONH
2
membrana plasmaticamembrana plasmatica
NMN
NAD
NMN
lig
pnu E
10
6
11
NadR E. coli: Introduzione.  
8
 
 
 
 
Figura 5. PNC VI. Enzimi: (4) nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi; (5) 
NAD
+
 sintetasi; (6) DNA ligasi; (7) NMN glicoidrolasi; (8) nicotinammide deamidasi; 
(9) nicotinato fosforibosiltrasferasi; (10) NAD
+
 pirofosfatasi. (Nm: nicotinammide; NA: 
acido nicotinico.) 
 
N
+
R P
COOH
N
+
R P P R
Ad
COOH
N
+
R P P R
Ad
COOH
NaAD NAD
nad D nad E
4 5
N
+
R P
CONH
2
N
COOH
NaMN
NMN
NMN
NA
membrana plasmaticamembrana plasmatica
NAD
lig
pnu E
pnc A
pnc B
9
8
6
10
7
N
CONH
2
Nm
NadR E. coli: Introduzione.  
9
Regolazione della via biosintetica del NAD
+
: il fattore di trascrizione 
NadR. 
      In Escherichia coli e Salmonella typhimurium la trascrizione dei primi due 
geni della sintesi de novo del NAD
+
, nadA e nadB (6, 7, 8) e la trascrizione di 
pncB (21, 22), che partecipa alle vie di recupero del dinucleotide piridinico, 
sono sotto il controllo negativo di una proteina codificata da un gene 
regolatore denominato nadR (6, 7), da alcuni indicato come nadI (8, 9, 19, 
20). 
      In entrambi gli organismi il locus nadR mappa vicino il gene pnuA, che 
codifica per un enzima coinvolto nel trasporto della nicotinammide (16), e il 
gene serB, che codifica per un enzima della sintesi della serina (15).  
      Escherichia coli e Salmonella typhimurium sono in grado di trasportare 
dall’ambiente esterno, attraverso la membrana citoplasmatica, la molecola 
intatta dell’NMN, che viene poi utilizzata per la sintesi del NAD
+
. Coinvolta 
nel trasporto del mononucleotide è la proteina di membrana PnuC, codificata 
dal gene pnuC, che forma un operone con nadA (17, 18). 
      Mutazioni nadR possono originare fenotipi difettosi nella regolazione 
della trascrizione, fenotipi carenti nel trasporto dell’NMN e fenotipi mancanti 
di entrambe le funzioni (18, 19, 21). Il gene nadR da Salmonella typhimurium 
è stato clonato e sequenziato (18): plasmidi ricombinanti per il nadR, 
NadR E. coli: Introduzione.  
10
introdotti in ospiti con fenotipi difettosi nella regolazione genica e nel 
trasporto dell’NMN, complementano tali funzioni (18). Mutazioni che 
spengono la regolazione genica, senza influenzare il trasporto, sono 
localizzate verso l’estremità ammino terminale della proteina (21); mutazioni 
nella regione carbossilica, invece, annullano la funzione di trasporto, senza 
alterare la capacità di legare il DNA (21). 
      Il NadR è quindi una proteina bifunzionale che agisce da repressore per 
regolare la biosintesi del NAD
+
 e partecipa al trasporto dell’NMN. È stato 
ipotizzato che il NadR sia una proteina allosterica: l’una o l’altra funzione si 
realizzerebbe in risposta ai livelli intracellulari del dinucleotide piridinico. In 
presenza di alti livelli di NAD
+
, NadR assumerebbe una conformazione adatta 
alla funzione di repressore e interagirebbe con nadA, nadB, pncB, 
bloccandone la trascrizione; in carenza di NAD
+
, NadR assumerebbe una 
conformazione adatta alla funzione di trasporto, per favorire l’ingresso 
dell’NMN esterno, lasciando contemporaneamente libera la trascrizione di 
nadA, nadB, pncB. Sarebbe proprio l’interazione diretta tra NAD
+
 e NadR a 
far assumere a quest’ultima una delle due conformazioni funzionali (fig. 6, 7). 
 
 
 
NadR E. coli: Introduzione.  
11
                                               NMN 
                                                  
 
                                    PnuC 
 membrana plasmatica             membrana plasmatica membrana 
 
                                 NadR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Modello proposto per la natura bifunzionale del NadR: a basse 
concentrazioni intracellulari di NAD
+
, il NadR permette la trascrizione di nadA, nadB, 
pncB e interagisce con la proteina di membrana PnuC, per favorire il trasporto di NMN 
all’interno della cellula. 
 
 
                                                                       NMN 
 
                                    PnuC 
 membrana plasmatica             membrana plasmatica membrana 
 
            NAD
+
 
 
 
 
 
            NadR 
 
 
 
 
Figura 7. Modello proposto per la natura bifunzionale del NadR: ad alte concentrazioni 
intracellulari di NAD
+
, il NadR, interagendo con il dinucleotide, cambia conformazione, 
si stacca dalla NMN permeasi (PnuC) e reprime la trascrizione dei geni nadA, nadB e 
pncB. 
DNA // //nadA nadB pncB
DNA // //nadA nadB pncB
NadR E. coli: Introduzione.  
12
      È stato importante l’isolamento di un mutante, nadR
S
 (21), denominato 
super repressore, che non era più sottoposto ad alcun tipo di regolazione, nel 
senso che il NadR inibiva costantemente la trascrizione dei geni nadA e nadB. 
In questo mutante, la proteina NadR era probabilmente bloccata nella 
conformazione che permette la regolazione genica. Quattro mutazioni nadR
S
 
su cinque mappavano nella zona centrale del gene, suggerendo che la 
sequenza amminoacidica, da questa codificata, fosse responsabile del 
passaggio da una conformazione all’altra, a seguito della probabile 
interazione con il NAD
+
 (21). Tuttavia, non sono state trovate nel NadR 
sequenze consensus tipiche di proteine che legano dinucleotidi, anche se sono 
presenti due sequenze consensus per il legame di mononucleotidi: Gly-X-X-
X-Gly-Lys, nella regione ammino terminale, Gly-X-X-X-X-Gly-Lys-Ser, 
nella regione centrale (18). L’ipotesi che sia proprio il NAD
+
, interagendo o 
meno con la zona centrale del NadR, a spingere la proteina verso una delle 
due conformazioni possibili e quindi a determinare una delle funzioni a queste 
collegate, non è stata fino ad ora dimostrata. È interessante sottolineare che la 
sequenza consensus presente nella regione centrale del NadR e tipica di 
proteine che legano l’ATP, è anche presente nel sito di legame per il NAD
+
 di 
una famiglia di aldeidi deidrogenasi NAD
+
 dipendenti (23, 24). 
NadR E. coli: Introduzione.  
13
      Recentemente sono state approfondite le conoscenze sull’interazione 
DNA-NadR (22). La proteina da Salmonella typhimurium, iperespressa in 
Escherichia coli e purificata, è stata sottoposta a studi di interazione con il 
DNA e nei geni nadA, nadB e pncB sono state evidenziate tipiche regioni 
consensus, chiamate NAD
+
box, nelle quali si è dimostrato avere luogo il 
legame di NadR. I geni nadA e nadB presentano due NAD
+
box, che si 
sovrappongono a un potenziale sito di legame per l’RNA polimerasi (box 1) e 
a un potenziale sito di legame per il ribosoma (box 2), favorendo forse la 
formazione di un’ansa nel DNA. Il gene pncB ha un solo NAD
+
box completo, 
che si sovrappone a un potenziale sito di legame per il ribosoma; così pncB è 
regolato meno strettamente rispetto a nadA e nadB (22). 
      L’interesse per il NadR del laboratorio in cui ho svolto il lavoro oggetto 
della presente tesi è scaturito dai risultati di una ricerca in banca dati con il 
programma BLAST (25), che hanno evidenziato una significativa omologia di 
sequenza tra il NadR da Escherichia coli e Salmonella typhimurium con 
l’enzima NMN adeniltrasferasi da Methanococcus jannaschii (13). L’NMN 
adeniltrasferasi, codificato dal gene nadD, nella via biosintetica del NAD
+
 
catalizza il trasferimento del gruppo adenilico dell’ATP all’ NMN o desamido 
NMN con formazione di NAD
+
 o desamido NAD
+
, e liberazione di 
pirofosfato (fig. 3, 4, 5). 
NadR E. coli: Introduzione.  
14
Una regione di 29 amminoacidi, presente nella parte ammino terminale 
dell’NMN adeniltrasferasi da Methanococcus jannaschii è significativamente 
omologa a una regione centrale del NadR da Escherichia coli e Salmonella 
typhimurium (fig. 8). 
 
 
 
 
Figura 8. Omologia di sequenza tra NMN adeniltrasferasi da Methanococcus 
jannaschii, NadR da Escherichia coli e NadR da Salmonella typhimurium. In rosso sono 
riportati i residui amminoacidici identici e simili. 
 
 
 
      La presenza nel NadR di tale sequenza, conservata in tutte le NMN 
adeniltrasferasi da archaea (12, 13), da eubatteri (44) e da eucaria (45, 46) ha 
indotto ad ipotizzare un’attività NMN adeniltrasferasica associata al NadR 
che, a partire da NMN e ATP, sarebbe così capace di sintetizzare NAD
+
. A 
tale proposito è importante sottolineare che fino ad oggi, in letteratura, sono 
riportati solo pochissimi esempi di fattori trascrizionali dotati di attività 
enzimatica (26, 27).  
NMN AT da Metahanococcus jannaschii: 
1 -----------LRGFIIGRFQPFHKGHLEVIKKIAEEVDEIIIGIGSAQKS-------HT 42
NadR da Escherichia coli: 
61 FLGLEFPRQKKTIGVVFGKFYPLHTGHIYLIQRACSQVDELHIIMGFDDTRDRALFEDSA 120
NadR da Salmonella typhimurium: 
53 FLGLEFPRRQKNIGVVFGKFYPLHTGHIYLIQRACSQVDELHIIMGYDDTRDRGLFEDSA 112
 
NadR E. coli: Introduzione.  
15
      Scopo della presente tesi è il clonaggio e l’espressione del nadR da 
Escherichia coli, al fine di verificare e studiare l’attività NMN 
adeniltrasferasica della proteina ricombinante.