Profili di espressione di geni di difesa in genotipi di pomodoro

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Il controllo biologico degli insetti dannosi in agricoltura sarà nel prossimo futuro 
un elemento di fondamentale importanza nel contenimento dei danni prodotti alle 
colture agricole e nel controllo della diffusione di malattie mediate da insetti. 
Molti agenti dannosi all’agricoltura ed alla salute umana stanno già sviluppando 
gradi crescenti di resistenza ai più comuni insetticidi che, usati in quantità sempre 
più massiccia, pongono gravi problemi di inquinamento e di tossicità per l’uomo e 
per la fauna selvatica. 
Oggi, si sta cercando di sviluppare delle strategie alternative per la protezione 
delle colture agricole dagli insetti dannosi e tra gli approcci perseguibili sono 
sicuramente di rilievo quelli che si basano sullo studio dei meccanismi endogeni 
di difesa della pianta. Tale studio è molto importante perchè da esso possono 
scaturire informazioni su nuovi fonti di geni e molecole in grado di esercitare 
un’azione di contenimento degli insetti fitofagi. 
 
1.2. Le risposte della pianta agli insetti dannosi in agricoltura 
Le piante, essendo degli organismi sessili e non potendo allontanarsi dal pericolo, 
sono sottoposte continuamente a delle sfide lanciate dall’ambiente in cui esse 
stesse vivono. Invece di agire come una vittima passiva a questo tipo 
d’interazione, la pianta identifica gli stimoli esterni, valuta la natura dei pericoli 
(in modo da assegnare loro un livello di priorità) e dà vita a delle risposte di difesa 
flessibili e dinamiche in modo da tollerare sia assalti persistenti che nuovi attacchi 
(Kaloshian e Walling, 2005). 
Le piante e gli insetti coesistono, di fatto, da più di cento milioni di anni, e hanno 
sviluppato nel corso del tempo una serie di relazioni che influenzano gli organismi 
a tutti i livelli. Non sorprende, pertanto, che le strategie messe in atto dalla pianta 
per cercare di resistere o evadere gli insetti erbivori siano molte e diverse tra di 
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loro. Le difese della pianta contro gli insetti sono state inizialmente viste in 
termini di composti che la pianta sintetizza durante il normale corso di crescita e 
sviluppo. Questi composti sono accumulati e conservati, così che quando 
attaccata, la pianta già presenta i mezzi per dissuadere o uccidere l’insetto 
(Gatehouse, 2002). Questa tipo di difesa può essere definita “costitutiva”, in 
quanto è sempre presente nella pianta. La difesa costitutiva ha solitamente azione 
diretta ed è efficace contro i generalisti (insetti con ampia gamma di specie 
vegetali nella loro dieta). Inoltre, le difese costitutive sono rappresentate da 
barriere fisiche (ad esempio: pareti lignificate, resine, ispessimenti di callosio e 
suberine), e dalla produzione di composti con azione deterrente, anti-deponente e 
molecole tossiche che possono agire anche tramite la distruzione delle membrane, 
inibendo il trasporto e la trasduzione del segnale o il metabolismo dell’insetto 
(Harbourne, 1998; Bennett e Wallsgrove, 1994). Poiché il costo metabolico dei 
meccanismi di difesa costitutivi sarebbe troppo alto da sostenere costantemente 
nel tempo (Baldwin e Preston, 1999), la pianta ha sviluppato delle risposte di 
difesa che sono indotte dall’attività alimentare degli insetti, difese che sono atte 
quindi a diminuire le prestazioni del fitofago e la suscettibilità della pianta ma ad 
aumentare la sua fitness. Questo tipo di difesa normalmente coinvolge un 
induzione sistemica, in quanto la risposta di difesa non si ottiene solo a livello del 
sito di danno ma attraverso tutta la pianta, come risultato dell’azione di molecole 
segnale che sono in grado di comunicare tra i differenti tessuti della pianta 
(Gatehouse, 2002). 
 
1.2.1.  Le difese dirette della pianta 
Le difese indotte possono essere classificate in dirette o indirette. Le prime 
interferiscono direttamente con il comportamento alimentare, la crescita, lo 
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sviluppo e la riproduzione dei fitofagi, le seconde, invece, interferiscono 
indirettamente con le popolazioni di fitofagi, esaltando l’azione dei loro nemici 
naturali (Walling, 2000). Le difese indotte dirette possono essere inquadrate in due 
categorie. Nella prima rientrano le difese di tipo meccanico anche dette 
antixenotiche, che derivano dagli adattamenti morfologici del vegetale, come per 
esempio la spinosità, la tomentosità e la pubescenza, la presenza di peli 
ghiandolari, la durezza tegumentale, la secrezione di lattice, cere, resine etc., da 
interpretare come delle vere e proprie barriere strutturali della pianta che possono 
ostacolare o addirittura precludere l’accesso alle risorse nutritive necessarie agli 
erbivori di cui gli insetti fitofagi e fitomizi sono una rilevante componente 
(Solinas, 1993; Tremblay, 2003). Ci sono numerosi esempi dell’induzione di 
difese di tipo anatomico in seguito al danno causato dall’insetto. In Salix cinerea, 
ad esempio, si osserva un maggiore incremento della densità dei tricomi sulle 
foglie in seguito all’attacco del coleottero Phratora vulgatissima (Dalin e 
Bjorkman, 2003). 
Nella seconda categoria vanno incluse le difese di tipo antibiotiche o 
biochimiche, che prevedono la sintesi di nuovi composti che sono tipici di 
ciascuna pianta e sono in grado di interferire con i processi digestivi e di 
assorbimento dei nutrienti degli insetti fitofagi (Felton e Gatehouse, 1996). Infatti, 
queste sostanze sono generalmente raggruppate in base al loro meccanismo 
d’azione in antidigestivi e antinutritivi. I primi sono composti che riducono 
l’assorbimento dell’alimento ingerito, mentre i secondi influenzano il processo di 
alimentazione dell’insetto in quanto alterano la disponibilità fisica e/o le 
caratteristiche chimiche dell’ alimento (Duffey e Stout, 1996). Diverse ricerche 
hanno rivelato una grande varietà di piccole molecole, derivanti dal metabolismo 
secondario, con effetto tossico o antinutrizionale, tra cui terpenoidi, alcaloidi, 
tannini, saponine e glucosidi. Tali molecole agiscono in modo sinergico con altre 
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difese della pianta. Oltre a queste sostanze con azione tossica la pianta produce in 
risposta all’attacco altre proteine di difesa. Tra queste di maggior rilievo sono gli 
enzimi Polifenolo Ossidasi (POX) e Lipossigenasi (LOX) che modificano 
covalentemente le proteine dell’insetto introdotte con la dieta, attraverso la 
formazione di chinoni altamente reattivi che sono in grado di reagire con i gruppi 
sulfidrilici delle proteine riducendone la qualità nutritiva, e di perossidi, 
rispettivamente (Constabel et al., 1995, Felton et al., 1994). Tra le proteine 
antidigestive spiccano gli inibitori di proteasi (PI), che sono indotti in seguito a 
ferita e attacco di insetti erbivori (Ryan, 1990). Questi inibitori indeboliscono le 
performance dell’insetto in quanto interferiscono con l’attività delle proteasi 
digestive presenti nell’intestino, con conseguente carenza di aminoacidi essenziali 
disponibili per l’assorbimento e rallentamento della crescita e sviluppo dell’insetto 
erbivoro (Zavala et al., 2004). Ad esempio, Royo et al. (1999) hanno dimostrato 
che su piante transgeniche di patata, in cui era stata soppressa la sintesi degli 
inibitori di proteasi tramite un meccanismo di RNA antisenso, vi era un maggiore 
crescita sia del coleottero Leptinotarsa decemlineata che del lepidottero 
Spodoptera exigua, dimostrando l’importanza di questi inibitori nei meccanismi di 
resistenza ad insetti masticatori. 
Molto spesso una netta distinzione tra i sistemi di difesa costitutivi e indotti 
decade in quanto i prodotti finali di questi meccanismi di difesa e i loro composti 
coincidono o si sovrappongono. Difatti molte proteine con azione tossica prodotte 
nelle risposte di difesa indotta vengono accumulate anche per le difese costitutive 
in base anche ad un programma di sviluppo della pianta. Un tipico esempio è 
rappresentato dagli inibitori di proteasi che sono immaganizzati nei tuberi di 
patata oltre ad essere indotte in seguito a ferita (Guarcia-Olmedo et al., 1987). 
D’altra parte è divenuto chiaro che i composti di difesa prodotti dal metabolismo 
secondario e attivi per le difese costitutive possono essere parte integrante dei 
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meccanismi indotti. Infatti, in Brassica napus si ottiene un incremento nel 
contenuto di glucosinolati dopo attacco da parte del coleottero Psylliodes 
chrysocephala (Bartlet et al., 1999). La sintesi di nicotina, il principale alcaloide 
in tabacco, avviene durante il normale sviluppo della pianta ma può essere anche 
indotta dall’attacco di erbivori (Halitschke et al., 2000). 
 
1.2.2. Le difese indirette della pianta 
Oltre i sistemi di difesa precedentemente descritti, le piante possono mettere in 
atto dei meccanismi di difesa indiretta in cui la pianta limita la dannosità del 
fitofago potenziando l’efficacia dell’entomofago, il quale rappresenta il terzo 
livello trofico che agisce ad un livello superiore dell’interazione pianta-insetto 
fitofago. La pianta instaura col nemico naturale un rapporto mutualistico sia 
fornendo rifugio e nutrimento (ad es. nettare extrafiorale) sia, soprattutto, 
producendo composti chimici volatili (semiochimici) che facilitano 
l’individuazione della pianta attaccata dall’insetto-preda. 
 
1.2.2.1.  I composti organici volatili 
L’emissione di composti organici volatili (VOC) dai tessuti vegetali occupa un 
importante ruolo nell’interazione tra pianta e insetto, sia per il richiamo degli 
insetti pronubi che nella protezione dagli attacchi di insetti erbivori. Piante sane 
emettono nell’atmosfera molti di questi composti, ma in seguito a ferita, attacco di 
patogeni o la presenza di insetti in alimentazione cambia la quantità e la qualità 
dei volatili rilasciati (Walling, 2000). Questi ultimi possono agire come segnali sia 
per gli insetti fitofagi, i quali sfruttano tali molecole per poter discriminare tra la 
pianta ospite e non ospite e per stimare la densità di popolazione di insetti già 
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presenti sulla pianta, che per i loro nemici naturali ai quali sono forniti dei segnali 
affidabili e sicuri che gli consentono di individuare la pianta infestata dal suo 
ospite. Sono diversi i fattori che vanno ad influenzare le categorie di molecole 
presenti nelle miscele di VOC. Alcuni dipendono dall’insetto fitofago (tra cui lo 
stadio di sviluppo e la specie di fitofago che attacca la pianta) altri relativi alla 
pianta (tra cui la specie, il genotipo e l’età) (Dicke, 1999). Inoltre, la sintesi e il 
rilascio di VOC in seguito a ferita ha luogo sia localmente che sistematicamente 
(Rose et al., 1996). Alcuni di questi composti sono comuni a differenti specie di 
pianta, come ad esempio i composti C
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quali aldeidi, alcoli e esteri, denominati 
“green leaf volatiles”, i composti C
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 e C
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 quali terpenoidi e indoli (Parè e 
Tumlinson,1999), mentre altri sono prodotti del metabolismo secondario e sono 
specifici per ogni pianta. I VOC contribuiscono direttamente alla difesa della 
pianta, ma più di ogni altra cosa giocano un ruolo chiave nelle strategie di difesa 
indiretta. Nella difesa diretta, i composti volatili possono esercitare un effetto 
tossico o repellente; infatti ci sono evidenze che composti volatili prodotti da 
tabacco possono impedire l’ovideposizione dei lepidotteri (Kesseler e Baldwin, 
2001). Bisogna aggiungere che non è chiaro se tale comportamento sia associato 
ad un’azione tossica/repellente esercitata da questi composti, o se l’insetto evita 
l’ovideposizione su piante che percepisce come già danneggiate. Sussistono 
diverse prove del coinvolgimento dei VOC nei sistemi di difesa indiretta, che è 
stato dimostrato per la prima volta da Sabelis e van de Baan (1983) in esperimenti 
con l’acaro predatore Phytoseiulius persimilis. Infatti, essi hanno osservato che 
questo acaro era attratto da piante di Phaseolus lunatus infestate con Tetranychus 
urticale ma non dalle stesse piante non infestate. Un ulteriore esempio è 
rappresentato da studi condotti su piante di Brassica spp. infestate da larve di 
Pieris brassicae. Tali piante, in seguito alla produzione dei composti volatili, 
risultavano attrattive per il parassitode Cortesia rubecola (Geervliet et al., 1994).