Produzione di Proteine Eterologhe dal Lievito Kluyveromyces lactis

Anche K. lactis è un organismo classificato GRAS ed è  largamente impiegato nella 
produzione di proteine eterologhe poiché, rispetto ad S. cerevisiae, ha mostrato una resa 
superiore e una migliore secrezione delle proteine espresse, oltre ad una maggiore 
stabilità dei vettori. K. lactis ha anche la capacità di crescere su substrati poco costosi 
come il siero di latte (prodotto di scarto dell’industria casearia), grazie ad una permeasi 
specifica e alla β-galattosidasi, enzima che catalizza la scissione del lattosio in glucosio 
e galattosio. 
 
In K. lactis sono presenti dei plasmidi naturali. In alcuni ceppi si trovano i plasmidi 
lineari citoplasmatici pGKL1 e pGKL2, che costituiscono il cosiddetto sistema DNA-
killer. Il pGKL1 per il suo mantenimento dipende dal pGKL2; il plasmide pGKL1 
codifica sia le tre subunità (α, β, γ) della tossina eterotrimerica zimocina, sia gli 
elementi che determinano la resistenza a tale tossina.  
I segnali di secrezione delle componenti del complesso della zimocina possono essere 
utilizzati fusi con geni eterologhi in produzioni biotecnologiche. 
 
Un altro plasmide naturale di K. lactis è il pKD1 (o 1.6 µm) che appartiene, come il 2 
µm di S. cerevisiae, alla famiglia dei plasmidi circolari di lievito. L’elevata stabilità e 
l’alto numero di copie (60-80 copie per cellula) che caratterizzano il pKD1 lo rendono 
un ottimo vettore in cui inserire cassette d’espressione contenenti geni eterologhi. 
 
K. lactis è un lievito anaerobio facoltativo e la sua capacità di produrre energia 
utilizzando la respirazione o la fermentazione è regolata da fattori ambientali come la 
disponibilità di ossigeno e di glucosio. 
In K. lactis, in condizioni respirative, il piruvato entra nel ciclo di Krebs, dopo essere 
stato modificato in acetil-CoA dal complesso della piruvato deidrogenasi (PDH), per 
essere ossidato completamente a CO
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, con produzione finale di ATP accoppiata al 
trasporto degli elettroni; in condizioni fermentative invece viene indotto l’utilizzo della 
piruvato decarbossilasi (PDC) che catalizza la decarbossilazione del piruvato ad 
anidride carbonica ed acetaldeide, che a sua volta viene trasformata in etanolo grazie 
all’azione dell’alcool deidrogenasi (ADH), figura 1. 
 
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 Figura 1 Schema del metabolismo del glucosio in K. lactis 
 
 
La piruvato decarbossilasi catalizza quindi il primo passaggio della via fermentativa di 
utilizzazione degli zuccheri. Questo enzima richiede come cofattori sia la tiamina 
pirofosfato (TTP) che il Mg
++
. L’unico gene codificante per la PDC in K. lactis è 
KlPDC1. 
Nella regolazione dell’espressione di questo gene è coinvolto il gene RAG3, che 
codifica per un regolatore trascrizionale; sulla sequenza del promotore del gene 
KlPDC1 sono presenti inoltre 5 siti di legame per il regolatore trascrizionale Gcr1p. 
Rag3p ha una azione coordinata positiva sia sulla sintesi della PDC che sul suo 
cofattore TPP, mentre agisce negativamente sulla piruvato deidrogenasi, che catalizza la 
conversione ossidativa alternativa del piruvato e svolge quindi una funzione basilare 
nella regolazione tra metabolismo fermentativo o respirativo. 
Le caratteristiche del promotore del gene della PDC e la sua regolazione lo rendono un 
elemento interessante da utilizzare nelle cassette d’espressione per la produzione di 
proteine eterologhe: è infatti un promotore forte, regolato dalla fonte di carbonio. 
 
 
 
Obiettivo di questo lavoro è valutare la produzione di glucoamilasi e di laccasi in ceppi 
di K. lactis trasformati con dei vettori d’espressione che presentano il promotore 
inducibile del gene KlPDC1 a monte del gene eterologo. 
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I ceppi di K. lactis utilizzati permettono di provare l’effetto dei geni RAG3 e GCR1 
sulla regolazione del promotore del gene KlPDC1 e quindi sull’ espressione di queste 
proteine. 
Nel caso della glucoamilasi, per verificare la forza del promotore del gene KlPDC1, si è 
anche effettuato un confronto con un vettore d’espressione contenente il promotore 
costitutivo del gene GAPDH di S. cerevisiae; inoltre si è valutata la produzione di 
questo enzima in ceppi di lievito in cui è stato deleto il gene codificante la PDC 
(autoregolazione). 
L’attività delle proteine eterologhe, che sono state ottenute secrete nel mezzo di coltura, 
è stata stimata qualitativamente e quantitativamente. 
 
 
La glucoamilasi è un enzima saccarificante (cioè scinde l’amido in glucosio) che agisce 
sulle estremità non riducenti dell’amido o delle destrine: idrolizza i legami glucosidici α 
1-4 e, se pur lentamente, quelli α 1-6, con inversione della configurazione anomerica. Il 
saggio di attività enzimatica per la determinazione dell’efficienza di produzione di 
questa proteina si basa sulla caratteristica del complesso formato dall’amido, substrato 
dell’enzima, con lo iodio di avere un picco di assorbimento nel visibile a 580 nm.  
Mediante una analisi Northern è stata anche valutata la quantità di trascritto relativa al 
gene codificante questo enzima. 
La glucoamilasi è stata infine visualizzata per frazionamento tramite elettroforesi. 
 
 
La laccasi è una proteina che utilizza l’ossigeno molecolare per ossidare diversi 
composti, aromatici e non, attraverso un meccanismo catalitico di tipo radicalico; è 
coinvolta, ad esempio, nel turnover metabolico di composti organici come la lignina. Il 
saggio di attività enzimatica si basa sulla reazione di questo enzima con l’ABTS (acido 
2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico)), seguendo l’aumento di assorbanza a 
420 nm, corrispondente all’aumento di concentrazione dell’ABTS in forma ossidata. 
La produzione di laccasi è stata anche valutata in scala semi-pilota, in bioreattore con 
vessels da 1 litro. 
 
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Per entrambe le proteine eterologhe si sono avuti livelli di produzione soddisfacenti. 
Inoltre dai risultati è emersa l’importanza del gene RAG3 sulla regolazione del 
promotore utilizzato, e in mancanza di RAG3 (mutanti di delezione rag3∆), è risultata 
fondamentale una mutazione specifica nel gene GCR1 per ripristinare i livelli di 
produzione a valori elevati. 
Questo lavoro ha dunque permesso di concludere che i ceppi di K. lactis utilizzati, in 
particolare quelli caratterizzati da genotipo RAG3 e gcr1-1, sono buoni produttori di 
glucoamilasi e di laccasi. Tale sistema biologico è anche di potenziale interesse per 
applicazioni su scala pilota. 
 
 
Nel primo capitolo verrà introdotto il lievito come sistema biologico per la produzione 
di proteine eterologhe, saranno descritte le caratteristiche principali del lievito K. lactis 
e le sue applicazioni in campo biotecnologico,  e si descriveranno i vettori impiegati in 
tale campo. 
 Nel secondo capitolo verrà illustrato in dettaglio il metabolismo del glucosio in K. 
lactis, oltre che la funzione e la regolazione del gene codificante la PDC; saranno quindi 
descritti i ceppi di K. lactis utilizzati in questo lavoro, e l’obiettivo di questo ultimo. 
Nel terzo capitolo si introdurrà prima la glucoamilasi, poi verranno descritti i vettori 
utilizzati per l’espressione di questo enzima, oltre che le misure eseguite ed i risultati 
ottenuti. Nel quarto capitolo sarà affrontata in modo simile l’espressione della laccasi. 
Infine nel quinto capitolo verranno riportate la discussione dei risultati ottenuti e le 
conclusioni di questo studio. 
 
  
 
 
 
 
 
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Capitolo I
 
 
 
 
Produzione di Proteine Eterologhe e Kluyveromyces lactis 
 
 
 
                                             
 
1.1-Lievito e produzione di proteine eterologhe 
 
 
 Il lievito è un eucariote unicellulare appartenente al 
regno dei funghi. 
Generalmente le cellule di questo organismo 
presentano una forma ovoidale o sferoidale ed hanno 
dimensioni variabili  da pochi µm a 20-30 µm; la loro 
struttura interna è quella delle cellule eucariotiche, ma 
come le cellule batteriche hanno una parete cellulare che ricopre la membrana 
citoplasmatica. 
 
Esistono sia specie aerobie che anaerobie facoltative; per queste ultime specie il corredo 
enzimatico cellulare non è lo stesso in tutte le condizioni ambientali, e la possibilità di 
intervenire dall’esterno sulla regolazione del metabolismo è importante poiché questo 
può essere indirizzato verso la produzione e l’accumulo di un prodotto d’interesse. 
 
Le condizioni ottimali di crescita sono generalmente una temperatura compresa tra i 
20°C e i 30°C, ed un intervallo di pH di 4.5-5.5. 
 
Solitamente nel lievito la riproduzione è asessuata ed avviene per gemmazione (fig. 
1.1.1 e fig. 1.1.2), ma in particolari condizioni si può avere la riproduzione sessuata 
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mediante il processo di coniugazione e la successiva meiosi che porta alla formazione di 
quattro spore aploidi contenute nell’asco (fig. 1.1.2). 
 
 
Figura 1.1.1 Gemmazione di cellule di lievito 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.1.2 Ciclo vitale del lievito 
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La coniugazione può avvenire solo se  i nuclei hanno fattori di sessualità diversi (a ed 
α). Se i fattori di sessualità sono stabili, la specie si dice eterotallica e si può effettuare 
facilmente un’analisi genetica formale. 
I lieviti sono importanti sia nella ricerca scientifica di base, sia nell’industria 
biotecnologica (principalmente farmaceutica ed alimentare). 
Questo grazie alla rapidità di crescita; alla relativa facilità con cui possono essere 
manipolati geneticamente rispetto ad organismi pluricellulari e diploidi; e perché, grazie 
alla loro organizzazione eucariotica subcellulare, possono portare avanti la maggior 
parte delle reazioni di ripiegamento e di modifiche post traduzionali necessarie per 
avere proteine eterologhe biologicamente attive 
(1)
. 
Il lievito Saccharomyces cerevisiae, ad esempio, è universalmente riconosciuto come 
sistema modello per lo studio dell’espressione dei geni eucariotici.  
Il suo genoma è stato completamente sequenziato nel 1996, ed è costituito da una 
sequenza di 12068 Kb (circa 6000 geni) organizzata in 16 cromosomi 
(2)
. 
E’ considerato un lievito fermentativo (anche in presenza di ossigeno più del 90% del 
glucosio metabolizzato viene incanalato nella via fermentativa), ed è utilizzato nella 
produzione di vino e birra, e nell’industria panaria. 
Viene anche impiegato per la produzione di proteine eterologhe e per applicazioni 
farmaceutiche essendo un organismo classificato GRAS (Generally Regarded As  
Safe)
(1)
; tramite questo lievito è stato prodotto l’ antigene superficiale del virus 
dell’epatite B 
(3)
, ormai utilizzato comunemente come vaccino, ed una forma tronca 
all’estremità C terminale della glicoproteina E2 del capside del virus dell’ epatite C 
(6)
. 
 
Nell’uso di S. cerevisiae  per la produzione di proteine eterologhe si incontrano però 
diversi problemi come basse rese (circa 1-5% delle proteine totali), bassa stabilità dei 
vettori plasmidici, apparato di secrezione inefficiente (spesso le proteine non si 
ritrovano nel terreno di coltura ma rimangono intrappolate nello spazio periplasmatico), 
e talvolta le proteine prodotte sono iperglicosilate causando problemi di 
immunogenicità e attività biologica 
(1, 4, 5)
. 
 
 10
Una soluzione a questi problemi è l’utilizzo di sistemi di lievito alternativi come 
Kluyveromyces lactis (che verrà trattato successivamente), Pichia pastoris, Hansenula 
polymorpha, e Schizosaccharomyces  pombe 
(1)
. 
Ad esempio, tramite P. pastoris è stata ottenuta una forma attiva di rh-chimasi umana
(7)
, 
una serina proteasi coinvolta in numerosi processi fisiologici come infiammazioni, 
rilascio di fattori di crescita, espulsione di parassiti, etc.. I meccanismi di glicosilazione 
di questo lievito sono stati umanizzati sostituendo i geni strutturali della via di 
glicosilazione con i corrispondenti geni umani al fine di ottenere la secrezione di 
proteine umane correttamente glicosilate 
(8, 9)
. 
 
 
 
 
 
 
1.2-Kluyveromyces lactis 
 
Gli studi su Kluyveromyces lactis iniziarono negli anni 
’60, ed inizialmente fu chiamato Saccharomyces lactis. 
Il lievito K. lactis è strettamente correlato a S. cerevisiae 
in quanto tra i due lieviti possono essere scambiati 
diversi geni strutturali. 
Il sequenziamento del suo genoma è stato ultimato nel 2004 ed è costituito da una 
sequenza di 10.6 Mb organizzata in 6 cromosomi 
(10)
. 
Le cellule di questo lievito sono più piccole rispetto a quelle di  S. cerevisiae; è una 
specie eterotallica con una predominanza del ciclo aploide 
(10)
 (la fase diploide è 
transitoria), ed il suo habitat naturale è vario. 
Diversi ceppi di K. lactis  sono stati isolati da derivati del latte, ed una caratteristica 
principale di questo lievito è proprio la capacità di sfruttare il lattosio come unica fonte 
di carbonio. Il gene LAC12 codifica per la permeasi del lattosio, che consente il 
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